富油酸擬桿菌的菌株培養(yǎng)與操作步驟及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-02-08 09:05:48
擬桿菌綱的種類很多生活在人或者動(dòng)物的腸道中，有些時(shí)候成為病原菌。在糞便中，以細(xì)胞數(shù)目計(jì)，擬桿菌屬(Bacteroides)是主要微生物種類。
一、菌種簡介
規(guī)格：凍干粉/培養(yǎng)物
拉丁名：Bacteroides
培養(yǎng)基：特殊蛋白胨：23.0，可溶性淀粉：1.0，氯化鈉：5.0，瓊脂：10.0，pH：7.3±0.2（25℃）
生長條件：37℃；4-5天；厭氧；
存儲(chǔ)條件：2-8℃
安全等級：1
菌株形態(tài)：菌落直徑為0.5-1mm，圓形，邊緣不整齊，不透明，正面白色，中間凸起，表面明亮，表面光滑，質(zhì)地濕潤，易挑起，G－（紅），桿菌。
模式菌株：yes
用途：教學(xué)，研究
注意事項(xiàng)：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動(dòng)物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準(zhǔn)）
二、菌株培養(yǎng)
1、菌種是指食用菌菌絲體及其生長基質(zhì)組成的繁殖材料。菌種分為母種（一種）、原種（二種）和栽培種（三種）三。工業(yè)發(fā)酵的有用菌種，其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復(fù)篩。
2、挑選具有某種能力的有用菌種，也稱種子制備，是指菌種在一定條件下，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的純生產(chǎn)菌種的制備過程。以作接入發(fā)酵罐中進(jìn)一步擴(kuò)大菌體量及合成產(chǎn)物之用。
3、種子制備包括孢子制備和菌絲體制備菌種制備。
4、保存在沙土管或冷凍管中的生產(chǎn)菌種，用無菌手續(xù)挑取少許，接入瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25℃（或較高溫度）下培養(yǎng)5～7天（或較長時(shí)間。所得孢子還需進(jìn)一步用較大表面積的固體培養(yǎng)基以獲得更多孢子（對于霉菌類孢子制備，多數(shù)采用大米、小米之類的天然培養(yǎng)基）。
5、將培養(yǎng)成熟的斜面孢子制成懸浮液，接種到扁瓶固體培養(yǎng)基上，于25～28℃培養(yǎng)14天。將成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中備用。一次制得的孢子瓶可在生產(chǎn)上延續(xù)使用半年左右。
6、如果有些生產(chǎn)菌種不產(chǎn)孢子，如赤霉素產(chǎn)生菌或產(chǎn)孢子不多的，則可采用搖瓶液體培養(yǎng)制得菌絲體，作種子罐的種子。種子罐的目的是使接入有限的孢子或菌絲體迅速發(fā)芽、生長、繁殖成大量菌體。其中的培養(yǎng)基組分應(yīng)是易于被菌體利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米漿），及無機(jī)鹽(如磷酸鹽)等。作為發(fā)酵罐的種子應(yīng)生命力旺盛、染色深、菌絲粗壯，無雜菌及異常菌體。接種量一般在10%～20%。
三、操作步驟
①準(zhǔn)備上述平板 1-2 塊（提前置于厭氧環(huán)境除氧24h）；②安全柜中打開，用酒精燈灼燒頂部，后迅速滴上無菌水使之破裂，隨后用鑷子將其敲碎；③吸取 0.5mL 無菌水打入凍干管，充分溶解菌粉后，打入平板中 200μL/個(gè)，涂布均勻；④將平板置于上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，菌種長出即可使用。
四、保藏條件
安瓿瓶凍干菌種和培養(yǎng)物應(yīng)在 2-8°C 保存。西林瓶菌種請置于-20℃冷凍。甘油保藏溫度為-80°C;請勿長期置于室溫。
五、注意事項(xiàng)
1）凍干粉首次活化，干粉要全部用完，不能預(yù)留，用無菌吸管吸取 0.3ml 的培養(yǎng)液（即以上建議的培養(yǎng)基配方，不加瓊脂）或者無菌水，滴入凍干管中，輕輕振蕩至其溶解。吸取全部菌懸液，接種在培養(yǎng)基上（建議不超過 2 支平板或者斜面，若接種液體培養(yǎng)基，則試管液體不超過 5ml 為宜）；
2）經(jīng)過冷凍干燥保藏，菌種處于休眠狀態(tài)，復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)延遲生長，這時(shí)需較長的培養(yǎng)時(shí)間； 若您收到的是已復(fù)蘇的培養(yǎng)物（非凍干菌），則可以直接用于您的實(shí)驗(yàn)，或根據(jù)需要轉(zhuǎn)接培養(yǎng)如有不明白之處，請務(wù)必先咨詢我單位技術(shù)人員，避免不必要的損失；
3）微生物菌種應(yīng)保藏于低溫、清潔干燥的地方，室溫放置時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致菌種衰退；
4）菌種操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行；轉(zhuǎn)種完畢，應(yīng)經(jīng)滅菌再做丟棄處理；
5）應(yīng)根據(jù)菌種狀況及時(shí)轉(zhuǎn)接，凍干菌種保藏時(shí)間通常為 2-25 年；
6）菌種使用過程中如出現(xiàn)雜菌污染或菌種生產(chǎn)性能下降或不活，請?jiān)谑盏胶?2 個(gè)月內(nèi)和
微生物菌種查詢網(wǎng)聯(lián)系，逾期不予受理；
7）打管操作需由專業(yè)微生物技術(shù)人員在相應(yīng)的防護(hù)設(shè)備中進(jìn)行，生物危害程度為三類的菌種應(yīng)在生物安全柜中操作，打管時(shí)凍干管應(yīng)遠(yuǎn)離面部，保護(hù)眼睛。
8）安瓿瓶開封：用浸過 75％酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，用火焰加熱其頂端，滴少量（2-3滴）無菌水至加熱頂端使之破裂，用銼刀或者鑷子敲下已破裂的安瓿管頂端并將凍干管開口處在火焰上過一遍，并保持在火焰旁操作。
9）甘油管使用：使用本甘油菌時(shí)可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或進(jìn)行液體培養(yǎng)即可。也可以完全融解后使用，但隨著凍融次數(shù)的增加，細(xì)菌的活力會(huì)逐漸下降。
六、保藏方法
1、傳代培養(yǎng)保藏法
又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用），培養(yǎng)后于4-6℃冰箱內(nèi)保存。
2、液體石蠟覆蓋保藏法
是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當(dāng)延長保藏時(shí)間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。
3、載體保藏法
是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。
4、寄主保藏法
用于目尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。
5、冷凍保藏法
可分低溫冰箱（-20-30℃，-50-80℃）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6、冷凍干燥保藏法
先使微生物在低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對細(xì)胞的損害。
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