胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB適用性檢查與操作方法！
小楊 / 2025-01-04 08:48:30
一、培養(yǎng)基原理
胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物提供微生物生長所需的基本氮源和碳源，葡萄糖提供碳源，氯化鈉提供適宜的生理環(huán)境，磷酸氫二鉀提供緩沖環(huán)境以緩解細(xì)菌因發(fā)酵葡萄糖而產(chǎn)生的酸對pH的影響。
二、所需菌種
分三種情況：
A.用于無菌檢查
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]
白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]
黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]
B.用于MPN法細(xì)菌計(jì)數(shù)
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B)26003]
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]
C.用于微生物限度檢查
大腸埃希氏菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B)26003]
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]
乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B)50094]
三、檢查方法
試管接種法，進(jìn)行促生長能力檢查。
四、菌液制備與稀釋
挑取四代以內(nèi)（含四代）上述菌種的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h，使用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液或0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行十倍稀釋，制成每1ml含小于100cfu的菌懸液。
(稀釋梯度：通常情況下為10-6～10-7、枯草芽孢桿菌10-5～10-6)
挑取四代以內(nèi)（含四代）的白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，經(jīng)20～25℃培養(yǎng)2～3天；使用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液或0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行十倍稀釋，制成每1ml含小于100cfu的菌懸液。
(稀釋梯度：通常情況下為10-6～10-7)
挑取四代以內(nèi)（含四代）的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面中，經(jīng)20～25℃培養(yǎng)5～7天（生長大量黑色菌絲）,加入5ml含0.05%聚山梨脂80的pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。使用含0.05%聚山梨脂80的pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液或含0.05%聚山梨脂80的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行十倍稀釋，制成每1ml含小于100cfu的菌懸液。
(稀釋梯度：通常情況下為10-5～10-6，因菌絲數(shù)量不同，可能有誤差)
五、培養(yǎng)基制備
被檢培養(yǎng)基：稱取培養(yǎng)基30.0g于1000ml純化水中,微溫溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌15分鐘,冷卻，備用。
另準(zhǔn)備胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋菌懸液計(jì)數(shù)，培養(yǎng)基滅菌后置于44.5℃水浴保溫待用。
六、實(shí)驗(yàn)方法
1、培養(yǎng)基陽性組：取稀釋后的各試驗(yàn)菌懸液1ml分別加于預(yù)先制備的試管培養(yǎng)基中，每種細(xì)菌接種兩支試管。同時(shí)分別取1ml菌懸液加于無菌空平皿中，用于計(jì)數(shù)，每種細(xì)菌做兩個(gè)平板。
2、培養(yǎng)基陰性組：即空白對照，即不添加菌液。
3、接種量計(jì)數(shù)：步驟1中的平皿中，細(xì)菌傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，霉菌和白色念珠菌傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。同時(shí)每種培養(yǎng)基做1個(gè)空白。
4、培養(yǎng)條件：
無菌檢查：20～25℃培養(yǎng)14天或直至出現(xiàn)渾濁（不超過14天）
MPN計(jì)數(shù)：30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天
控制菌檢查：30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時(shí)
傾注計(jì)數(shù)用的的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板置30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天
傾注計(jì)數(shù)用的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板置20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天
七、觀察記錄方法
參考下述，長情況
——TSB試管渾濁，生長良好。
——TSB試管渾濁，有片狀菌團(tuán)出現(xiàn)
——TSB試管渾濁，培養(yǎng)基液面有菌膜生長。
——TSB試管澄清透明，底部有白色菌團(tuán)。
——TSB試管澄清透明，有白色或黑色菌絲團(tuán)生長。
F.接種量計(jì)數(shù)＝計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平均菌落數(shù)—計(jì)數(shù)培養(yǎng)基空白組菌落數(shù)
八、判定依據(jù)
接種量在<100CFU,加菌的培養(yǎng)基試管生長良好且與對照培養(yǎng)基相似，空白管無菌生長，則判定合格。
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