細(xì)胞詳述
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)骨髓中的造血干細(xì)胞（HSC）不僅有機(jī)械支持作用，還能分泌多種生長因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）來支持造血。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能，能促進(jìn)間充質(zhì)組織的再生，如：骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)等組織。
在骨髓中，BMSCs占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%~0.1%，含量極低。而同時(shí)，由于組織工程需要大量的種子細(xì)胞，從嚙齒類動(dòng)物骨髓分離BMSCs的技術(shù)上的難度限制了許多實(shí)驗(yàn)的開展。體外分離培養(yǎng)純度高、活力強(qiáng)、生物特性均一的BMSCs對(duì)組織工程及細(xì)胞的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)顯得至關(guān)重要。
該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40+GFP基因。
細(xì)胞篩選
該細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP的細(xì)胞，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其GFP熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱。若實(shí)驗(yàn)要求需要維持熒光強(qiáng)度，可以加入嘌呤霉素進(jìn)行再次篩選。 建議收到細(xì)胞后至少傳3代，凍存留種后再進(jìn)行篩選。
初次進(jìn)行細(xì)胞篩選時(shí)，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，若無細(xì)胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，以此類推，至最高藥物濃度為5ug/ml。若篩選過程中，漂浮細(xì)胞大于60%，則停止篩選，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞密度約80%，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進(jìn)行篩選。當(dāng)加入5ug/ml嘌呤霉素時(shí)細(xì)胞正常增殖，可停止篩選，用不含藥完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。
細(xì)胞特性
1） 組織來源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常骨髓血組織。
2） 細(xì)胞鑒定：CD44免疫熒光染色為陽性。
3） 經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。
4） 不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。
5） 細(xì)胞生長方式：長梭形細(xì)胞，不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。
產(chǎn)品的運(yùn)輸和保存
視天氣狀況和運(yùn)輸距離遠(yuǎn)近，公司與客戶協(xié)商后選擇下述方式中的一種進(jìn)行。
1) 1mL凍存細(xì)胞懸液裝于1.8ml的凍存管中，置于裝滿干冰的泡沫保溫盒中進(jìn)行運(yùn)輸；收到細(xì)胞后請(qǐng)盡快解凍復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，如無法立刻進(jìn)行復(fù)蘇操作，凍存細(xì)胞可在-80℃的條件下保存1個(gè)月。
2) T-25培養(yǎng)瓶充滿完全培養(yǎng)基后進(jìn)行常溫運(yùn)輸；收到細(xì)胞后請(qǐng)鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，如鋪瓶率超過85%請(qǐng)立即進(jìn)行傳代操作，如懸浮的細(xì)胞較多，請(qǐng)將培養(yǎng)瓶至于培養(yǎng)箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細(xì)胞能夠再次貼壁。
推薦培養(yǎng)基
我們推薦使用原代間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系作為體外培養(yǎng)原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。
名稱 體積 濃度 保存條件
原代間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 500ml 1× 4℃、避光
原代間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑 5ml 100× -20℃、避光
胎牛血清（FBS） 50ml 終濃度10% -20℃、避光
雙抗（青霉素/鏈霉素，P/S） 5ml 100× -20℃、避光
產(chǎn)品使用
1) 本產(chǎn)品僅能用于科研
2) 本產(chǎn)品未通過直接用于活體動(dòng)物和人的審核
3) 本產(chǎn)品未通過用于活體診斷的審核
操作流程
復(fù)蘇
1將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到37℃；
2準(zhǔn)備一支15ml離心管，加入5ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基，放入37℃水浴鍋中預(yù)熱；
3戴上護(hù)目鏡，厚毛線手套后，從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡快轉(zhuǎn)入37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動(dòng)凍存管以提高復(fù)溫速率；
4將融化了的凍存管中的細(xì)胞吸入事先準(zhǔn)備的離心管中，混勻后，1000rpm離心5min；
5準(zhǔn)備一個(gè)T-25培養(yǎng)瓶，寫上細(xì)胞名稱、日期，再加入4ml完全培養(yǎng)基；
6離心完成后棄去上清，用1ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入T-25細(xì)胞培養(yǎng)中，混勻后轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)靜置。
注意：從液氮中取出細(xì)胞凍存管時(shí)，若凍存管內(nèi)有液氮進(jìn)入，需擰松凍存管，排出內(nèi)部殘留的液氮，之后擰緊凍存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。
傳代 （細(xì)胞傳代建議一傳二）
1 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上時(shí)，可進(jìn)行傳代。
2 在生物安全柜內(nèi)，打開培養(yǎng)瓶瓶口，收集瓶內(nèi)的培養(yǎng)基；
3 向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入3ml無菌的1×PBS 后，水平放置培養(yǎng)瓶，使PBS能夠浸潤到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄PBS；
4 向瓶內(nèi)加入消化液1ml，浸潤底面后放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育1~2min；
5 孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓飄起，若全部消化下來則直接向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入2ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基中，將懸液吸入15ml離心管；
注：如還有部分細(xì)胞未消化下來，可采用分步消化：
① 準(zhǔn)備一個(gè)無菌的15ml離心管，加入2ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基；
② 將消化下來的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入1ml胰酶繼續(xù)消化2min左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入2
