我國對化妝品中綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法!-ATCC菌種
綠膿桿菌在自然界分布甚廣，空氣、水、土壤中均有存在。對人有致病力，常引起人皮膚化膿感染，特別是燒傷、燙傷、眼部疾病患者被感染后，常使病情惡化，并可引起敗血癥，因此，在化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定不得檢出綠膿桿菌。
1 方法提要
根據(jù)本菌生物學(xué)特征：革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42℃條件下生長等，可與類似菌相區(qū)別。
2 培養(yǎng)基和試劑
2.1 SCDLP 液體培養(yǎng)基
見GB 7918.1-87《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 總則》。
2.2 十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基
成分： 牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
氯化鈉 5g
十六烷三甲基溴化銨 0.3g
瓊脂 20g
蒸餾水 1000ml
制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào)pH為7.4～7.6，加入瓊脂，115℃(10 1b)20min滅菌后，制成平板備用。
2.3 乙酰胺培養(yǎng)基
成分：乙酰胺 10.0g
氯化鈉 5.0g
無水磷酸氫于鉀 1.39g
無水磷酸二氫鉀 0.73g
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5g
酚紅 0.012g
瓊脂 20g
蒸餾水 1000ml
制法：除瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，121℃(15 1b)20min高壓滅菌后，制成平板備用。
2.4 綠膿菌色素測定用培養(yǎng)基
成分： 蛋白胨 20g
氯化鎂 1.4g
硫酸鉀 10g
瓊脂 18g
甘油(化學(xué)純) 10g
蒸餾水 1000ml
制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加溫使溶解，調(diào)pH至7.4，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內(nèi)，115℃(10 1b)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?br />
2.5 明膠培養(yǎng)基
成分： 牛肉膏 3g
蛋白胨 5g
明膠 120g
蒸餾水 1000ml
制法：取各成分加在蒸餾水中浸泡20min，隨時(shí)攪拌加溫使溶解，調(diào)pH至7.4，分裝于試管內(nèi)，經(jīng)115℃(10 1b)20min滅菌后，直立制成高層備用。
2.6 硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基
成分： 蛋白胨 10g
酵母浸膏 3g
硝酸鉀 2g
亞硝酸鈉 0.5g
蒸餾水 1000ml
制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加溫使溶解，調(diào)pH為7.2，煮沸過濾后補(bǔ)足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，115℃(10 1b)20min滅菌后備用。
2.7 普通瓊脂斜面培養(yǎng)基
成分：蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化鈉 5g
瓊脂 15g
蒸餾水 1000ml
制法：除瓊脂，將其余成分溶解于蒸餾水中，調(diào)pH為7.2～7.4，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，121℃(15 1b)15min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?br />
３ 儀器
3.1 培養(yǎng)箱：37℃、42℃。
3.2 錐形燒瓶。
3.3 試管。
3.4 滅菌平皿。
3.5 滅菌刻度吸管。
3.6 顯微鏡。
3.7 載玻片。
3.8 接種針、接種環(huán)。
3.9 電爐。
3.10 高壓消毒鍋。
4 操作步驟
4.1 增菌培養(yǎng)：取1：10樣品稀釋液10ml加到90ml SCDLP液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)18～24h。如有綠膿桿菌生長，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。
注：如無SCDLP液體培養(yǎng)基時(shí)，可用普通肉湯培養(yǎng)基。檢驗(yàn)含防腐劑的化妝品時(shí)，在每1000ml普通肉湯中加1g卵磷脂、7g吐溫80。
4.2 分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18～24h。凡綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無守型，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素，此培養(yǎng)基選擇性強(qiáng)，大腸艾希氏菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。
在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離，將菌液劃線接種于平皿中，放37℃培養(yǎng)24H，綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶紅色，其他菌不生長。
4.3 染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。
4.4 氧化酶試驗(yàn)：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基對苯二胺試液，在15～30s之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí)，為氧化酶試驗(yàn)陽性，若培養(yǎng)物不變色，氧化酶試驗(yàn)陰性。
4.5 綠膿菌素試驗(yàn)：取可疑菌落2～3個(gè)，分別接種在綠膿菌素測定用培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)24h，加入氯仿3～5ml，充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)，待氯仿提取液呈藍(lán)色時(shí)，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1N的鹽酸1ml左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。
4.6 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)：挑取被檢的純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?br />
4.7 明膠液化試驗(yàn)，取綠膿桿菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置37℃培養(yǎng)24h，取出放冰箱10～30min，如仍呈溶解狀時(shí)即為明膠液化試驗(yàn)陽性，如凝固不溶者為陰性。
4.8 42℃生長試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放在41～42℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48h，綠膿桿菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。
5 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告
被檢樣品增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽性者，即可報(bào)告被檢樣品中檢出有綠膿桿菌。如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和４２℃生長試驗(yàn)三者皆為隉性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中有綠膿桿菌。