一、背景
OLN-93細胞系大鼠膠質(zhì)細胞是一種大鼠膠質(zhì)前體細胞系，來源于大鼠腦組織，OLN-93細胞系由原代大鼠腦膠質(zhì)細胞培養(yǎng)中自發(fā)轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生的。
二、OLN-93細胞系|大鼠膠質(zhì)細胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）OLN-93細胞系|大鼠膠質(zhì)細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）OLN-93細胞系|大鼠膠質(zhì)細胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、OLN-93細胞系|大鼠膠質(zhì)細胞處理：
1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?50px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
注：di一次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。
3）OLN-93細胞系|大鼠膠質(zhì)細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
三、應(yīng)用
OLN-93細胞系|大鼠膠質(zhì)細胞可以用于莫諾苷對Oln-93細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用及機制研究：
莫諾苷是從山茱萸中提取出來的天然活性小分子物質(zhì),已有研究表明它對神經(jīng)元有抗氧化抗凋亡的保護效果,但是對神經(jīng)膠質(zhì)細胞的作用報道甚少,因此,本實驗采用Oln-93細胞(大鼠少突膠質(zhì)前體細胞)作為研究對象,探究莫諾苷對Oln-93細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用和作用機制,希望為神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療提供新的實驗依據(jù)和思路。
方法：
1、建立Oln-93細胞氧化應(yīng)激模型及藥物處理:Oln-93細胞被孵育不同濃度的過氧化氫(H2O2),用MTT方法確定細胞的最適損傷濃度和處理時間;不同濃度的莫諾苷(Morroniside)預(yù)孵育細胞24h,用合適濃度的H2O2損傷,MTT法確定最適的加藥濃度。
2、使用倒置顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)變化。
3、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒進行各組細胞毒性檢測。
4、使用丙二醛(MDA)試劑盒檢測各組細胞脂質(zhì)氧化程度。
5、使用活性氧(ROS)檢測試劑盒檢測各組細胞內(nèi)ROS釋放量。
6、應(yīng)用JC-1熒光探針和熒光顯微鏡檢測各組細胞線粒體膜電位(MMP)變化,觀察細胞凋亡情況。
7、使用TUNEL試劑盒檢測各組細胞TUNEL表達情況。
8、使用Hoechst33342活性細胞染色劑對細胞核染色觀察各組細胞胞核形態(tài)變化。
9、提取各組細胞蛋白,進行Western Blot方法檢測氧化相關(guān)蛋白i NOS、SOD2和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、AKT、P-AKT、Caspase3的表達情況。
10、應(yīng)用AKT通路抑制劑LY294002,檢測以上氧化和凋亡指標,進一步探討莫諾苷的作用機制。
結(jié)果：
1、MTT法檢測細胞活性,結(jié)果顯示莫諾苷對H2O2誘導(dǎo)的細胞活性下降有明顯的改善作用。
2、細胞形態(tài)學結(jié)果顯示莫諾苷能明顯改善H2O2損傷Oln-93細胞造成的破碎、皺縮等形態(tài)變化。
3、LDH細胞毒性檢測結(jié)果表明,H2O2損傷后細胞釋放LDH明顯增多,莫諾苷能明顯降低細胞LDH的釋放。
4、脂質(zhì)氧化檢測結(jié)果顯示,莫諾苷抑制細胞內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生過氧化,顯著減少H2O2誘導(dǎo)的MDA產(chǎn)量。
5、ROS檢測結(jié)果表明,莫諾苷能顯著降低H2O2誘導(dǎo)的Oln-93細胞的ROS釋放量。
6、線粒體膜電位檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),莫諾苷能明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的線粒體膜電位的降低。
7、TUNEL檢測結(jié)果表明,莫諾苷能明顯減少H2O2誘導(dǎo)的TUNEL表達,對細胞凋亡有顯著的抑制作用。
8、Hoechst33342染色結(jié)果表明,H2O2處理使細胞核呈現(xiàn)皺縮、破碎和不規(guī)則的凋亡形態(tài),莫諾苷能明顯減少發(fā)生凋亡的細胞數(shù)量。
9、Western Blot檢測結(jié)果表明莫諾苷能顯著降低i NOS表達,提高抗氧化蛋白SOD表達,并且能降低促凋亡蛋白Bax、Caspase3表達,提高抗凋亡蛋白Bcl-2和P-AKT表達。
10、應(yīng)用LY294002孵育Oln-93細胞后進行檢測。
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