一、背景
NCI-H1299人非小細胞肺癌貼壁細胞系來源于一個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。細胞均一性的部分缺失p53蛋白，并缺少p53蛋白表達。細胞可以合成0.1pmol/毫克蛋白的NMB蛋白，而不合成促胃液釋放肽(GRP)。
二、NCI-H1299人非小細胞肺癌貼壁細胞系培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基86%
優(yōu)質(zhì)胎牛血清10%
P/S青霉素-鏈霉素1%
GlutaMAX-1谷氨酰胺1%
HEPES 1M Buffer solution 1%
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉1%
注意：該細胞生長過程中培養(yǎng)基容易變黃需要及時換液。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
三、NCI-H1299人非小細胞肺癌貼壁細胞系處理：
1）凍存NCI-H1299人非小細胞肺癌貼壁細胞系細胞的復蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）NCI-H1299人非小細胞肺癌貼壁細胞系細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁NCI-H1299人非小細胞肺癌貼壁細胞系細胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）NCI-H1299人非小細胞肺癌貼壁細胞系細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。
四、應用
NCI-H1299人非小細胞肺癌貼壁細胞系可以用于人非小細胞肺癌NCI-H1299細胞特異性結(jié)合肽的篩選及鑒定：
利用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選與人非小細胞肺癌NCI-H1299細胞結(jié)合的小分子多肽并在體內(nèi)外鑒定其結(jié)合特異性及靶向性。
方法：
1、將人非小細胞肺癌NCI-H1299細胞接種于裸鼠體內(nèi),制備荷瘤裸鼠模型,用噬菌體展示隨機環(huán)七肽庫對荷瘤裸鼠進行3輪體內(nèi)篩選。免疫組織化學法鑒定噬菌體在腫瘤組織及正常對照組織的分布情況,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測噬菌體克隆對NCI-H1299細胞的結(jié)合親和力,鑒定陽性單克隆噬菌體。
2、提取陽性單克隆噬菌體DNA進行測序獲得外源多肽的氨基酸序列,將重復率最高的序列合成靶向肽NSP1,并進行異硫氰酸熒光素(fluorescein,FITC)標記合成熒光探針FITC-NSP1。通過肽與噬菌體的競爭抑制實驗鑒定所合成的靶向肽與NCI-H1299細胞的結(jié)合特異性。
3、CCK8法檢測熒光探針FITC-NSP1對NCI-H1299細胞增殖活性的影響;細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測熒光探針FITC-NSP1對NCI-H1299細胞遷移、侵襲的影響。
4、通過細胞免疫熒光實驗在倒置熒光顯微鏡下觀察FITC-NSP1與細胞的結(jié)合情況鑒定FITC-NSP1對NCI-H1299細胞的結(jié)合特異性;流式細胞術(shù)檢測FITC-NSP1對NCI-H1299細胞的結(jié)合特異性。
5、通過小動物活體成像實驗檢測熒光探針FITC-NSP1在體內(nèi)對腫瘤組織的靶向性,并檢測熒光探針的最適濃度以及最佳成像時間。分離小鼠腫瘤組織及正常組織進行離體實驗,進一步鑒定熒光探針的靶向性。
結(jié)果：
1、噬菌體肽庫在荷瘤裸鼠體內(nèi)經(jīng)過三輪篩選,與NCI-H1299細胞特異性結(jié)合的噬菌體克隆得到富集。第3輪篩選后噬菌體在腫瘤組織的回收率是首輪的341.3倍,富集效果明顯。
2、免疫組織化學結(jié)果顯示,腫瘤組織中富集的噬菌體隨每一輪體內(nèi)篩選的進行而增加,第3輪篩選后,與腫瘤組織結(jié)合的噬菌體明顯多于正常組織。
3、ELISA結(jié)果顯示隨機挑取的30個噬菌體克隆中有20個是陽性噬菌體克隆(親和力>2.5)。
4、陽性噬菌體克隆的測序結(jié)果顯示序列CTNESIGTC重復率最高,且與數(shù)據(jù)庫中已知氨基酸序列無相似性。將此序列合成靶向肽并命名為NSP1,同時進行FITC標記,合成靶向熒光探針FITC-NSP1和隨機對照熒光探針FITC-sv NSP1。
5、肽與噬菌體的競爭性抑制實驗顯示靶向肽NSP1可以和相應的陽性噬菌體克隆競爭結(jié)合NCI-H1299細胞。
6、CCK8結(jié)果顯示FITC-NSP1對NCI-H1299細胞增殖無明顯影響;細胞劃痕實驗及Transwell實驗結(jié)果顯示FITC-NSP1在各檢測時間段均不會對NCI-H1299細胞遷移、侵襲產(chǎn)生影響。
7、細胞免疫熒光實驗結(jié)果顯示FITC-NSP1與NCI-H1299細胞結(jié)合的熒光強度為103.553±8.412,而隨機對照熒光探針FITC-sv NSP1與NCI-H1299細胞結(jié)合的熒光強度為9.653±0.880,兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),此外FITC-NSP1不與其他癌細胞及正常細胞結(jié)合(P<0.01),表明FITC-NSP1對NCI-H1299細胞具有特異性。
8、流式細胞術(shù)結(jié)果顯示FITC-NSP1標記NCI-H1299細胞的陽性百分比為70.54±2.15,明顯高于其他細胞(P<0.01),隨機對照熒光探針FITC-sv NSP1標記的NCI-H1299細胞百分比為7.22±0.36,與FITC-NSP1相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
9、小動物活體成像結(jié)果顯示FITC-NSP1在體內(nèi)會逐漸累積在腫瘤部位,具有靶向性,且在4h時腫瘤組織的熒光強度達到最大,離體實驗結(jié)果顯示FITC-NSP1不會富集在其他正常組織。
結(jié)論：本研究采用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選得到與NCI-H1299細胞特異結(jié)合的小肽NSP1,并在體內(nèi)體外鑒定NSP1光學分子探針與肺癌細胞的結(jié)合特異性和靶向性,為非小細胞肺癌的早期診斷和靶向治療的研究奠定了基礎(chǔ)。
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