一、背景
原代細胞是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞。有人把培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。原代細胞不僅廣泛應用于分子、細胞生物學和生物醫(yī)學基礎研究，如蛋白質組學、基因組學、細胞株（系）研究、DNA，RNA和遺傳學研究等，還可應用于當今熱門的生物醫(yī)藥產業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。原代細胞在生物醫(yī)藥領域有不可替代性作用，市場前景廣闊。
原代細胞的培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。
最常用的原代細胞的培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。
組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進行培養(yǎng)。
分散細胞培養(yǎng)大致步驟為：將動物組織從機體中取出離散成單個細胞(常用胰蛋白酶)，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖(注意整個過程無菌)。
二、應用
原代細胞可以用于瓦氏雅羅魚鰓、腸組織及原代細胞在堿脅迫下的鈣調蛋白表達機制研究：
以耐高堿自然優(yōu)勢種瓦氏雅羅魚(Leuciscus waleckii)作為研究對象,建立魚體鰓、腸細胞的原代及傳代培養(yǎng)體系,探究堿脅迫對瓦氏雅羅魚原代鰓、腸細胞的增殖能力及功能的影響,同時分析了鈣調蛋白(Calmodulin,CAM)在鰓、腸組織及細胞中的表達情況,從而在瓦氏雅羅魚堿耐受機制角度達到對鈣調蛋白作用機理的初步分析?；诖?本研究主要評估了瓦氏雅羅魚鰓、腸細胞對急、慢性堿耐受性及鰓、腸組織的生長發(fā)育狀態(tài),觀察了堿脅迫下瓦氏雅羅魚血清中Ca2+含量,從而對鈣調蛋白的基因表達量變化進行生理到組織再到細胞的多層次解讀。
本研究采用胰蛋白酶消化法和密度梯度離心法對鰓、腸細胞進行分離、純化后,將細胞懸液均分置于DMEM(Dulbecco’s Modified Eagles Medium)、MEM(Minimum Essential Medium)和L-15(Leibovitz Medium)三種培養(yǎng)基中進行細胞培養(yǎng)實驗。在該過程中,分時段分別采用血細胞計數(shù)板測定細胞增殖數(shù),用細胞計數(shù)法測定細胞增殖率;同時,對其進行細胞來源和活性鑒定,分析原代鰓、腸細胞的生長狀態(tài)。
1、通過對兩細胞系進行長期培養(yǎng)和形態(tài)學觀察后發(fā)現(xiàn):瓦氏雅羅魚鰓、腸細胞原代培養(yǎng)時采用DMEM培養(yǎng)基可獲得穩(wěn)定、良好的培養(yǎng)效果,細胞生長狀態(tài)顯著優(yōu)于L-15和MEM;啟動原代培養(yǎng)的36-72 h,鰓、腸細胞生長代謝旺盛,其增殖規(guī)律符合經典“S”生長曲線;利用鈣調蛋白camk2g2基因(Locus Tag Prefixes:J5810)可在全身表達的特點進行細胞來源鑒定后證實：兩細胞確系分離自瓦氏雅羅魚。
2、堿脅迫對瓦氏雅羅魚鰓、腸細胞活性及功能的影響為探討堿脅迫對瓦氏雅羅魚原代鰓、腸細胞活性及功能的影響,本研究建立瓦氏雅羅魚鰓、腸細胞體外培養(yǎng)模型,采用NaHCO3作為主要耐受因素。實驗過程如下:加入10 mmol/L NaHCO3的新鮮DMEM培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后收集在660 nm(雙波長法)處檢測其吸光值,制作標準曲線確定波動范圍以方便后續(xù)堿梯度實驗指標測定。
隨后根據(jù)上述實驗結果:設置NaHCO3濃度梯度分別為0、2.5、5、7.5、10、12.5、25、50和75 mmol/L對鰓、腸細胞系進行耐受,然后將其放入CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h后,采用CCK-8法檢測兩細胞活性和存活率;DNA Ladder法測定鰓、腸細胞細胞凋亡及壞死情況,從而分析細胞生長代謝狀態(tài)。結果顯示:瓦氏雅羅魚鰓、腸細胞的最佳耐受時長為3h,耐受NaHCO3的最佳濃度為25～50 mmol/L;該條件下孵育的鰓、腸細胞均出現(xiàn)細胞凋亡特征。上述實驗表明:瓦氏雅羅魚體外培養(yǎng)鰓、腸細胞可耐受25～50 mmol/L NaHCO3高濃度堿生境,且該生存條件對兩細胞系的功能及活性皆可造成不同程度的細胞凋亡現(xiàn)象。
3、鈣調蛋白對瓦氏雅羅魚鰓、腸組織及細胞功能的影響本部分實驗分為組織學及細胞學兩個層次。
體外實驗:以瓦氏雅羅魚原代鰓、腸細胞為實驗對象,選取3個NaHCO3濃度(0、25和50 mmol/L)進行梯度耐受,經3 h孵育后通過測定原代細胞胞內Ca2+含量、camk2g2基因、內質網應激反應關鍵基因xbp1u與氧化應激反應關鍵基因gsr表達量,來探討離體條件下堿脅迫對瓦氏雅羅魚鈣調蛋白camk2g2的影響,并在細胞層面上探究該作用機制與非生物脅迫因子應激響應機制之間的潛在關聯(lián)。結果顯示：3 h堿耐受條件下,camk2g2在25 mmol/L NaHCO3耐受的鰓細胞中出現(xiàn)極顯著表達(<0.01),50 mmol/L NaHCO3耐受的鰓細胞中則出現(xiàn)顯著性上升(<0.05),但camk2g2在腸細胞中的表達量雖然隨著堿度的增加而增加,但未見顯著差異(>0.05)。
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