一、背景
酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒適用于酵母小規(guī)模高純度質(zhì)粒制備。采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞并結(jié)合lyticase特異消化酵母細(xì)胞壁，能在1小時(shí)內(nèi)從酵母培養(yǎng)液中分離出高純度質(zhì)粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除細(xì)胞壁后,然后堿裂法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低PH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
二、使用方法
1、從-20℃或更低的冰箱中取出血液樣品，室溫下靜置融化。
2、將400μL解凍的血液轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5mL的塑料離心管中，加入400μL溶液A，充分震蕩混勻。如果是禽類血液，則少加10倍，只加40μL。
3、在混合液中加入400μL溶液B和200μL氯仿(自備)，振蕩1分鐘。由于離心管比較滿，所以需要確保管底溶液轉(zhuǎn)動(dòng)起來(lái)，否則只是液面振動(dòng)而已。
4、4℃12000 g離心10分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移至一新的1.5mL塑料離心管中。注意：最好不要室溫離心，如果室溫離心，則離心后部分樣品的中間白色層可能會(huì)很厚，只能得到很少的上清。
5、將約0.7-0.8mL上清轉(zhuǎn)移到10-15mL塑料離心管中(不要使用玻璃離心管，否則DNA會(huì)吸附到管壁上。常用的培養(yǎng)提質(zhì)粒用的細(xì)菌的培養(yǎng)管即可)。
6、加入2.5倍上清體積的溶液C(2mL)，立即搖晃混勻。
7、將混合液分多次轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，每次0.7mL左右，轉(zhuǎn)移后靜置2-5分鐘，以使DNA與膜充分結(jié)合，然后室溫12000 g離心30秒，棄收集管中的廢液，然后再加入0.7mL，重復(fù)上述操作，直到全部混合液掛柱。
8、在離心吸附柱中加入0.7mL通用洗柱液，室溫12000 g離心30秒，棄收集管中的廢液。
9、在離心吸附柱中再加入0.3mL通用洗柱液，室溫12000 g離心30秒，棄收集管中的廢液。
10、室溫12000 g離心30秒，去盡殘留液體(此步驟十分重要，不要省略，否則殘留的含乙醇的通用洗柱液將抑制后續(xù)的酶反應(yīng))。
11、將離心吸附柱置于一新的1.5mL塑料離心管中，加入50μL DNA洗脫液2.0，室溫放置2分鐘。如果將DNA洗脫液2.0在65℃預(yù)熱后再使用，洗脫DNA的效果更佳。
12、室溫12000 g離心30秒，離心管底部溶液即DNA溶液，可立即使用或-20℃長(zhǎng)期保存。
三、應(yīng)用
用于PRV EPO基因酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒與PK-15細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建研究：
構(gòu)建了pGBKT7-EP0誘餌質(zhì)粒和PK-15細(xì)胞cDNA文庫(kù),為更好的研究PRV EP0蛋白與宿主細(xì)胞PK-15之間的相互作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。
具體研究?jī)?nèi)容如下：第一部分：構(gòu)建pGBKT7-EP0誘餌質(zhì)粒采用PCR技術(shù),擴(kuò)增獲得PRVEP0基因,將其克隆至酵母雙雜交載體pGBKT7中,獲得重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EP0,通過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoRI與Pst I雙酶切鑒定與基因測(cè)序結(jié)果分析,表明成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EP0。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到Y(jié)2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中,對(duì)其進(jìn)行毒性檢測(cè),自激活效應(yīng)檢測(cè),PCR以及Western-blot檢測(cè),結(jié)果表明誘餌質(zhì)粒表達(dá)的產(chǎn)物對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性作用,無(wú)自激活效應(yīng),PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EP0成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞,并且能夠表達(dá)融合蛋白BD-EP0-Myc。
第二部分：PK-15細(xì)胞cDNA文庫(kù)構(gòu)建及鑒定選取PRV的宿主細(xì)胞PK-15細(xì)胞來(lái)構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。本試驗(yàn)從PK-15細(xì)胞提取總RNA,采用SMART和LD-PCR合成全長(zhǎng)的ds cDNA,并對(duì)其進(jìn)行均一化和SfiⅠ酶切處理。將得到的dscDNA連接到三框表達(dá)載體中。將這三個(gè)重組反應(yīng)產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入到HST08電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中,構(gòu)建含有三種讀碼框的初級(jí)文庫(kù),該文庫(kù)庫(kù)容分別為3.0X 106、2.0×106和2.0×106 CFU,插入片段均在500bp以上,陽(yáng)性重組率均大于93%。再將三框初級(jí)文庫(kù)共同電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞HST08中進(jìn)行擴(kuò)增,提取質(zhì)粒文庫(kù)。最后將質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化到Y(jié)187酵母感受態(tài)細(xì)胞,得到的cDNA酵母文庫(kù)總庫(kù)容量為7.5×105 CFU,基本符合酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建要求。
綜上,成功構(gòu)建了符合酵母雙雜交篩選要求的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EP0和酵母cDNA文庫(kù),為進(jìn)一步研究PRV EPO蛋白與PK-15細(xì)胞蛋白之間的相互作用奠定了基礎(chǔ)。
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