百歐博偉生物：當(dāng)前食品的安全性問題日益受到重視 ，由于食品從原輔料、生產(chǎn)制造過程到消費的各個環(huán)節(jié)都可能受到各種微生物的影響，如果生產(chǎn)過程及工藝控制不當(dāng)，處理不徹底則很容易造成微生物的殘留和繁殖，影響產(chǎn)品的品質(zhì)甚至危及人體的身體健康。近年來隨著國家對食品安全重視程度的提高，食品飲料企業(yè)越來越注重微生物檢驗 ，以監(jiān)測食品生產(chǎn)，及早發(fā)現(xiàn)微生物的污染，利于采取措施防止微生物危害，保障食品安全。雖然國家標(biāo)準(zhǔn) G B／T 4 7 8 9.1 ～ 4 7 8 9.3 1 -2 0 0 3中對食品衛(wèi)生的微生物學(xué)檢驗方法、檢驗用的培養(yǎng)基、檢驗步驟作了具體規(guī)定，但在實際工作中還存在著許多復(fù)雜因素，忽視這些因素很可能給檢驗結(jié)果帶來偏差，甚至錯誤，從而無法正確評價產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況 ，無法正確指導(dǎo)與監(jiān)督產(chǎn)品生產(chǎn)。本文從培養(yǎng)基的水化、滅菌和使用、物理和生物學(xué)的質(zhì)量控制，談一些觀點和看法。希望有利于微生物檢驗工作的同行們更好的開展工作。
一、培養(yǎng)基的制備及水化
1、培養(yǎng)基的配制
自制培養(yǎng)基必須準(zhǔn)確根據(jù)處方，并作詳細(xì)記錄，因培養(yǎng)基處方中的成分大部分為生物制品，各廠家生產(chǎn)或同一廠家生產(chǎn)的不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量會有一定的差異性，因此應(yīng)對配方中的各原料成分進行相應(yīng)的質(zhì)量控制，另外，必須記錄所有用到的各種成分的全部特征( 如代碼和批次) 。特別注意的是自制的培養(yǎng)基各成分應(yīng)該分別添加，注意添加順序，并且分裝滅菌之前各成分應(yīng)互溶或完全均勻。
2、干粉培養(yǎng)基的使用
隨著微生物檢驗行業(yè)的發(fā)展，有了一系列商業(yè)化的干燥培養(yǎng)基，其以便利、實用和高效得到微生物檢驗行業(yè)的廣泛認(rèn)可。專業(yè)的培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)工藝，對原材料及成品進行嚴(yán)格的控制，以保證質(zhì)量合格、穩(wěn)定，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確和可重復(fù)性。
微生物檢驗用的各種藥品、試劑和干粉培養(yǎng)基必須是專業(yè)廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品，質(zhì)量必須符合有關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并且生產(chǎn)商應(yīng)提供培養(yǎng)基的名稱、產(chǎn)品編號、批號、各種成分和任何補充成分、培養(yǎng)基使用前的pH值、貯存資料及有效期等信息，以利于使用者對產(chǎn)品進行記錄和比較。
3、培養(yǎng)基水化的容器
培養(yǎng)基水化時不得用銅鍋或鐵鍋，以防有離子混入培養(yǎng)基中，影響微生物的生長；并防止部分或新玻璃瓶在加熱過程中會釋出堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)基的pH改變；容器的大小需大于復(fù)水后培養(yǎng)基總體積的2倍以上，避免在加熱溶解過程中，培養(yǎng)基溢出。
4、培養(yǎng)基水化的用水
使用蒸餾水或與其同質(zhì)的水，即不含有任何可能抑制或影響微生物生長的物質(zhì)。嚴(yán)重污染的去離子水即使經(jīng)過濾除菌還是可能含有抑制一些微生物生長的物質(zhì)；避免使用自來水，因其中含有氯等抗菌物質(zhì)；培養(yǎng)基水化時逐漸加入適量的水 ，可先將 1／3水量置入容器中，震搖后 ，再加入剩余的2／3水量，并順勢將附著于容器壁的培養(yǎng)基粉沖下。
5、培養(yǎng)基的稱量
稱量時要用專用的角匙，避免交叉污染而影響檢驗結(jié)果；稱量時注意不要吸入粉末，特別是選擇性培養(yǎng)基；培養(yǎng)基易吸潮，吸潮后可導(dǎo)致培養(yǎng)基酸化，改變培養(yǎng)基的p H等。如有條件，盡量在濕度較低的房間稱取培養(yǎng)基；干粉培養(yǎng)基應(yīng)嚴(yán)格按照生產(chǎn)商提供的有關(guān)說明準(zhǔn)確配制。
二、培養(yǎng)基的溶解及滅菌
1、培養(yǎng)基的溶解
在培養(yǎng)基分裝滅菌前，各成分應(yīng)溶解均勻，水浴加熱溶解最好，含有瓊脂的粉末狀培養(yǎng)基，在加熱溶解之前可以浸泡數(shù)分鐘；使用電爐等設(shè)備煮沸培養(yǎng)基時，應(yīng)用小火加熱，并邊加熱邊攪拌，避免培養(yǎng)基焦化或爆沸溢出。燒糊的培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)被破壞，并可產(chǎn)生有毒物質(zhì)。如發(fā)現(xiàn)焦化，或未溶解均勻前培養(yǎng)基有溢出，該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。
2、培養(yǎng)基的滅菌
一般培養(yǎng)基采用濕熱滅菌，即高壓蒸汽滅菌，通常是121℃ 15 m i n ，含糖或特殊培養(yǎng)基，按照生產(chǎn)廠家提供的說明滅菌。已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，配制培養(yǎng)基的用水、容器和干粉中均含有大量的微生物，溶解均勻后，要避免微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分， 改變培養(yǎng)基的酸堿度，產(chǎn)生有毒或未知物質(zhì)。如果配制體積比較多，要注意溶解充分、均勻，分裝時要注明培養(yǎng)基名稱、配制時間等。高溫可破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，特別是氨基酸、 維生素和糖；高溫還會使瓊脂的凝膠強度下降。在高溫情況下，某些營養(yǎng)成分還可能由于受熱而相互發(fā)生反應(yīng)，如磷酸鹽與碳酸鈣反應(yīng)形成不溶于水的磷酸鹽，使可溶性磷酸鹽的濃度大為降低，并易形成沉淀；還原糖與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成5一羥甲基糠醛和類黑精； 高溫反應(yīng)時可能形成有毒物質(zhì)，影響微生物生長。濕熱滅菌必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和時間。并且不可重復(fù)高溫滅菌。
某些強選擇性培養(yǎng)基不需要高壓蒸汽滅菌，可以通過煮沸法進行消毒，部分試劑可以在未滅菌的情況下使用。應(yīng)根據(jù)國際、國家標(biāo)準(zhǔn)或生產(chǎn)商提供的說明滅菌。
3、影響滅菌效果的因素
高壓蒸汽滅菌鍋在使用時，內(nèi)置物品不能太多，不要堆積形成死角；單位體積內(nèi)的內(nèi)容物( 每瓶內(nèi)的培養(yǎng)基) 不能太多， 一般固體 < 2 0 0 m l ， 液體 <1 L ，否則熱傳遞效果欠佳 ；并且要排放干凈冷空氣，否則實際溫度達(dá)不到設(shè)置溫度； 要定期對壓力表等進行檢定，檢定周期一般為半年；并定期對滅菌效果進行檢驗，可采用生物指示菌法、化學(xué)變色紙片等進行驗證。
三、平板的制備
1、培養(yǎng)基的 p H
微生物必須在適宜的 p H范圍內(nèi)才能正常生長繁殖或體現(xiàn)其生物特性。培養(yǎng)基配方要求的 p H為滅菌或消毒后的p H值，即培養(yǎng)基使用前的 p H，并應(yīng)在 2 5 ℃溫度下采用精密酸度計進行測量，固體瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)以特殊的膠體表面測量電極進行測量。
在使用過程中，如果需要調(diào)整培養(yǎng)基的 p H，應(yīng)用 1 mol/ L NaOH或 1 mol/L HC1 調(diào)整 pH，注意不可反復(fù)調(diào) p H，否則會影響培養(yǎng)基的滲透壓。
2、培養(yǎng)基的保溫
滅菌以后培養(yǎng)基應(yīng)該迅速冷卻至所需溫度，避免長時間保存在滅菌鍋內(nèi)，造成過度滅菌，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分或選擇性效果。采用水浴鍋保溫，水溫一般調(diào)至 4 5℃ ～55℃，水位液面應(yīng)略高于培養(yǎng)基液面，傾注平板時，取出培養(yǎng)基自然降溫至4 0℃ - 45℃左右。建議以較低的溫度進行平板傾注，可減少對樣品中微生物的熱損傷，并可減少平板表面的冷凝水，利于觀察結(jié)果。
3、補充物質(zhì)的添加
補充物質(zhì)有可能為有毒物質(zhì)，配制和添加時小心處理避免吸入粉末。采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書配制溶液。補充物質(zhì)一般為熱敏試劑。在培養(yǎng)基冷卻至 4 7℃±2 ℃時加入補充物質(zhì)，過冷的液體有可能導(dǎo)致瓊脂凝固或形成片狀物，補充物質(zhì)在加入時，應(yīng)為室溫或 4 0 ℃ 左右；輕柔順序加入補充物質(zhì)，然后盡可能快的分裝或傾注。
在某些情況下，抗生素溶液可以在合適的包裝下凍存，但在解凍以后再次凍存，可能會降低活性，必要時用戶應(yīng)該通過實驗驗證。補充物質(zhì)一般為活性物質(zhì)，不要使用過期產(chǎn)品。
4、傾注培養(yǎng)基
平板中培養(yǎng)基的厚度至少應(yīng)是 2mm( 如 90mm的平板，通常傾注 l5 ml培養(yǎng)基 ) ，平板放在冷而平的地方使瓊脂凝固。
四、培養(yǎng)基的接種與培養(yǎng)
1、培養(yǎng)基的接種
平板在接種使用時，表面必須無 明顯潮濕水珠，潮濕的平板容易造成菌落擴散 ，不易進行計數(shù)，或進行平板分離時 ，造成菌落不純。傾注平板培養(yǎng)基溫度較高會造成平板潮濕?？蓪⑵桨宸胖迷?2 5℃～ 5 0℃烘箱內(nèi)，至培養(yǎng)基表面的水滴完全消失，注意不要過度加熱。
對于保存的培養(yǎng)基，需待溫度回復(fù)至室溫后才可使用，并且使用前應(yīng)檢查 ：有無污染菌落形成、培養(yǎng)基顏色是否發(fā)生改變、固態(tài)培養(yǎng)基表面有無干裂現(xiàn)象、有無脫水現(xiàn)象等，一旦出現(xiàn)異常， 該培養(yǎng)基應(yīng)作廢棄處理。
2、接種物的培養(yǎng)
瓊脂平板不要堆積高于 6個， 留有一定的空間使空氣流通，使平板的溫度盡快而均勻地接近設(shè)置溫度。在厭氧罐里應(yīng)堆積超過 6個平板的高度。對于液體培養(yǎng)基要依據(jù)培養(yǎng)基的體積、容器類型而定。培養(yǎng)時，瓊脂平板培養(yǎng)基有可能喪失一定的濕度。喪失1 5 ％ 的水含量時，在一些情況下將對微生物的生長不利。影響水分丟失的因素有培養(yǎng)基成分、平板中培養(yǎng)基的量、培養(yǎng)箱的類型、培養(yǎng)箱中平板的位置和數(shù)量、培養(yǎng)基溫度等。必要時，可放入裝水容器以維持箱內(nèi)的濕度。
五、培養(yǎng)基的物理學(xué)及生物學(xué)質(zhì)控
1、培養(yǎng)基的物理學(xué)控制
商品化的干燥培養(yǎng)基包裝應(yīng)易于達(dá)到密封條件，利于保存培養(yǎng)基的干燥性及光敏感成分的活性；制備的培養(yǎng)基平板應(yīng)有相應(yīng)的顏色，如血平板就為血紅色，一般的培養(yǎng)基應(yīng)澄清無渾濁、無沉淀；溶解溫度、凝固溫度應(yīng)做相應(yīng)的檢測，對于傾注平板的培養(yǎng)基，凝固溫度不應(yīng)高于 4 0 ℃，以利于低溫傾注平板 ，盡量減少對樣品中微生物的熱損傷。
2、培養(yǎng)基的生物學(xué)控制
培養(yǎng)基在滅菌后 ，應(yīng)做無菌實驗，以確保滅菌效果；使用培養(yǎng)基目標(biāo)菌生長率測試，非目標(biāo)菌的選擇因子測試；菌落大小及相應(yīng)生理生化特征檢測等。對每批產(chǎn)品應(yīng)用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株進行檢定，并對實驗的結(jié)果加以記錄。
六、培養(yǎng)基的貯存
干燥培養(yǎng)基在使用時，應(yīng)遵循先入先出的原則，貯存于陰涼干燥處，避免強光直射。如果培養(yǎng)基在稱量使用過程中，吸潮，發(fā)生結(jié)塊或顏色改變的培養(yǎng)基不可繼續(xù)使用。
建議平板傾注后立即使用。保存時，盡可能貯存在不會改變其成分的條件下，即避光和／ 或在 4 ℃ ～1 2℃冰箱密閉保存，減少培養(yǎng)基中有效成分和水分的揮發(fā)，保證檢出率。一般不超過 1 個星期或者遵循特定的標(biāo)準(zhǔn)或生產(chǎn)商的說明。在平板上標(biāo)上制備日期和／或有效期和名稱。
培養(yǎng)基的質(zhì)量是微生物實驗室檢測工作的基礎(chǔ)，事關(guān)檢測工作的準(zhǔn)確性、可靠性，在微生物實驗室檢測工作中舉足輕重。如果在工作中忽視任何一個環(huán)節(jié)的質(zhì)量問題， 都將導(dǎo)致檢驗結(jié)果科學(xué)性、客觀性的偏離。因此，加強培養(yǎng)基的實驗室質(zhì)量控制 ，認(rèn)真地做好培養(yǎng)基的質(zhì)控工作，不斷完善和提高培養(yǎng)基的質(zhì)控水平，才能為微生物檢測實驗室提供高質(zhì)量的培養(yǎng)基。
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