一、背景
植物組織直接PCR試劑盒利用該試劑盒可以在15分鐘內(nèi)開始從葉子（或其他植物組織）進行基因組DNA的PCR。該方法不需要用液氮對植物組織進行冰凍、機械處理、純化或者DNA的沉淀。該試劑盒也可以對提取的基因組DNA進行PCR擴增。PCR試劑含有染料，可以直接在電泳膠上樣。
0.5到0.7cm的植物葉片與提取液在95度孵育10分鐘提取基因組DNA。加入同樣體積的稀釋液中和。然后可以取部分提取物進行PCR擴增。植物組織直接PCR試劑盒采用獨特的溶液系統(tǒng)可以快速從植物葉片，種子等樣品中提取微量基因組DNA，可以在15-20min內(nèi)完成基因組DNA提取，提取的DNA可以馬上用于PCR反應，完全不需要其他去蛋白，RNA或者次生代謝產(chǎn)物的過程，足夠滿足快速檢測的需要，因此特別適合大規(guī)模基因檢測。
只需要微量的樣品（5mg左右）就能得到可以用于100次左右的PCR反應模板，節(jié)約用戶寶貴的實驗材料，整個過程不需要有機溶劑抽提等步驟，節(jié)省您寶貴的實驗時間，而且試劑中不含有毒物質(zhì)，免去實驗人員接觸有毒試劑的危險。使用本試劑盒提取的基因組DNA可以直接用于PCR擴增實驗，或者于4°C保存?zhèn)溆?。本試劑盒中提供?×Plant Master Mix具有很強的擴增兼容性，能直接以待測樣品裂解液為模板，進行高效特異性擴增。該試劑為2倍濃縮PCR反應混合液，包含了用于PCR擴增除模板和引物外的所有組分，大大簡化操作過程，降低污染幾率。
二、注意事項
1.試劑盒只適合于多糖多酚含量低的植物葉片樣本，如小麥、水稻、煙草、玉米、大豆、油菜等。不適合多糖多酚含量高的植物樣本。
2.建議使用新鮮采取的葉片組織，若為長期冷凍組織，應盡量避免反復凍融，否則會導致模板的降解，影響PCR效率。葉片組織以幼嫩為宜，若為成熟的葉片，避免使用葉片主脈部位組織。
3.電泳檢測時，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否則，電泳時會在泳道中出現(xiàn)一大團拖尾亮帶，影響實驗結果。
4.建議擴增片段長度1 kb以內(nèi)，以便擴增效率最佳。
三、應用
用于水稻黃綠葉基因YGL8和YGL9的克隆與功能分析
水稻(Oryza sativa L.)是世界上極其重要的糧食作物之一,同時也是單子葉植物研究的重要模式植物。水稻主要通過葉片中的葉綠體進行光合作用,合成碳水化合物并將其貯藏于稻谷中。葉色突變是植物中普遍存在的一種現(xiàn)象,一般來說,葉色突變體都涉及到光合色素含量的變化,因而直接體現(xiàn)在葉片顏色的變化上。光合色素的主要功能就是吸收光能和傳遞電子,因此,其在光合生物的光合過程中扮演著關鍵角色。大量的研究結果顯示,葉色突變體是研究植物光合色素代謝、葉綠體結構功能、葉綠體發(fā)育、光合作用以及光形態(tài)建成的理想材料。本研究利用了經(jīng)EMS(ethyl methane sulfonate)誘變秈稻恢復系縉恢10所產(chǎn)生的兩個黃綠葉突變體,克隆了兩個水稻黃綠葉基因YGL8和YGL9,并對其進行了功能互補驗證,同時,對這兩個基因的器官特性表達情況以及相關基因的表達情況進行了分析,也對這兩個基因所編碼的蛋白的結構和功能等進行了分析。
克隆了包含LOC_Os03g03990在內(nèi)的6812 bp野生型基因組序列(包括4373bp的編碼區(qū)上游序列、1167 bp的編碼區(qū)序列和1272 bp的編碼區(qū)下游序列)構建功能互補載體并轉(zhuǎn)化ygl9突變體愈傷組織,陽性轉(zhuǎn)化植株的葉片全部恢復了正常綠色且其葉綠素和類胡蘿卜素含量也達到野生型水平。這些結果證明,LOC_Os03g03990基因就是YGL9基因。YGL9蛋白結構分析系統(tǒng)進化樹顯示,YGL9屬于光合生物所特有的cp SRP43蛋白家族。亞細胞定位結果表明,YGL9位于葉綠體。氨基酸序列比對結果顯示,YGL9與擬南芥的cp SRP43的序列高度相似,其成熟蛋白可能也包含了3個CD(CD1-3)結構域和4個Ank(Ank1-4)結構域,這些結構域可能介導了蛋白與蛋白之間的相互作用。
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