一、材料與方法
1.實(shí)驗(yàn)菌株。本實(shí)驗(yàn)所采用的研究菌株（羊布魯氏菌55202，牛布魯氏菌55008，豬布魯氏菌55006，綿羊布魯氏菌55305，犬布魯氏菌55307，森林鼠布魯氏菌55224，單增李斯特氏菌54001，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌52301，大腸埃希氏菌44155）分別購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心、海洋種布魯氏菌贈(zèng)自青島海洋研究所，細(xì)菌培養(yǎng)基購(gòu)于北京蘭博瑞生物技術(shù)有限公司。
2.儀器試劑。細(xì)菌DNA提取試劑盒：細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）；Ex TaqDNA聚合酶、dATP、dUTP、dCTP、dGTP、PCR緩沖液、MgCl2、引物均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。
離心機(jī)：Eppendorf F10-uc，德國(guó)；微量移液槍：0.5-1000ul，Eppendorf；電泳儀：BIO-RAD，MODEL422，美國(guó)；分光光度計(jì)：Eppendorf；PCR基因擴(kuò)增儀（DB80220-26 美國(guó)）；凝膠成像儀；PCR基因擴(kuò)增試劑盒。
3.實(shí)驗(yàn)方法
（1）菌株的培養(yǎng)。樣品的制備及增菌培養(yǎng)均參照各菌的檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。
（2）細(xì)菌基因組DNA的抽提。采用寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒（貨號(hào)DV810A）并按其操作說(shuō)明進(jìn)行。
（3）PCR 反應(yīng)條件及體系。反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性5 min，93℃變性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃下保存。
反應(yīng)體系體積50μL：10×PCR緩沖液（Mg2+ Plus）5μL、引物對(duì)（20Pmol/L）各0.5μL、dNTP（2.5mmol/L）4μL、Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL、模板DNA1μL、水補(bǔ)足至50μL。
二、結(jié)果與分析
1.DNA提取結(jié)果的檢測(cè)。利用布魯氏菌肉湯培養(yǎng)基提取模板DNA，提取過(guò)程可參照相關(guān)細(xì)菌DNA提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。對(duì)于模板DNA提取質(zhì)量需經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，可以判定試驗(yàn)所提取的DNA抽提液是否含有DNA或是否適合于進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而可以避免出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的假陰性。剩余布魯氏菌肉湯增菌液恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，以備確證試驗(yàn)使用。
部分細(xì)菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示：
1.DL2000 DNA maker 2.海洋種布魯氏菌 3.豬布魯氏菌 4.牛布魯氏菌 5.綿羊布魯氏菌 6.犬布魯氏菌 7.森林鼠布魯氏菌 8.單增李斯特氏菌 9.大腸埃希氏菌 10.小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌
2.引物的優(yōu)化。在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，我們本著建立一種簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)方法的原則設(shè)計(jì)引物。通過(guò)對(duì)六種布魯氏菌同源序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)了利用PCR可以擴(kuò)增布魯氏菌屬的通用引物。
引物序列如下：
5，-TGGCTCGGTTGCCAATATTCAA-3，
5，-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3，
3.PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)結(jié)果見圖2所示的瓊脂糖凝膠電泳
布魯氏菌PCR擴(kuò)增的目的片段為223bp。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1.100bp DNA ladder Marker 2.海洋種布魯氏菌 3.豬布魯氏菌 4.牛布魯氏菌 5.綿羊布魯氏菌 6.犬布魯氏菌 7.森林鼠布魯氏菌
4. PCR產(chǎn)物基因測(cè)序結(jié)果
以上基因測(cè)序結(jié)果與已知布魯氏菌基因序列相同。
5.敏感度試驗(yàn)。將布魯氏菌研究菌株純培養(yǎng)物稀釋一系列濃度梯度，進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。由圖中可看出，PCR檢測(cè)限至10-7稀釋梯度，方法檢測(cè)限可達(dá)到約0.95pg/ul布魯氏菌DNA，檢測(cè)下限大約可檢測(cè)到19個(gè)布魯氏菌。
1.100bp DNA ladder Marker 2.稀釋10-4梯度 3. 稀釋10-5梯度 4.稀釋10-6梯度 5. 稀釋10-7梯度 6. 稀釋10-8梯度 7. 稀釋10-9梯度 6.特異性試驗(yàn)。其它種屬細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果為陰性。證明本方法所使用引物特異性強(qiáng)，能特異性檢出布魯氏菌，避免其它種屬細(xì)菌的干擾反應(yīng)。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1.100bp DNA ladder Marker 2.海洋種布魯氏菌 3.豬布魯氏菌 4.牛布魯氏菌 5.綿羊布魯氏菌6.犬布魯氏菌7.森林鼠布魯氏菌8.單增李斯特氏菌 9.大腸埃希氏菌 10.小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 11.水
7.模擬污染樣品試驗(yàn)。結(jié)果表明三個(gè)濃度菌懸液模擬污染樣品，PCR全部擴(kuò)增出布魯氏菌特異性產(chǎn)物，檢測(cè)結(jié)果如圖所示。
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1.100bp DNA ladder Marker 2.海洋種布魯氏菌 103CFU/ Ml 3.海洋種布魯氏菌 102 CFU/ mL 4.海洋種布魯氏菌 10 CFU/ mL 5.牛布魯氏菌 103 CFU/ mL 6.牛布魯氏菌 102 CFU/ mL 7.牛布魯氏菌10 CFU/ mL 8.水