微生物檢測標準操作程序中檢驗樣品準備的通用原則與流程！
小楊 / 2025-12-11 10:06:29
百歐博偉生物：在微生物檢測的標準操作程序（SOP）中，檢驗樣品的準備是核心前置環(huán)節(jié)，直接影響檢測結果的準確性和重復性。其核心目標是使樣品中的微生物均勻分散、去除干擾物質、制備符合檢測要求的菌懸液或稀釋液，不同類型樣品（固體、液體、半固體）的處理流程存在差異。以下是系統(tǒng)化的操作規(guī)范：
一、樣品準備的通用原則
1、無菌操作優(yōu)先
所有接觸樣品的器具（均質袋、吸管、移液槍頭、三角瓶等）需經滅菌處理（高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌或一次性無菌耗材）。
操作需在超凈工作臺或生物安全柜中進行，操作人員需穿戴無菌手套、口罩和實驗服。
避免樣品與非滅菌表面接觸，防止外源微生物污染。
2、樣品均一化
固體或不均勻樣品需通過均質、研磨等方式打破基質結構，使微生物充分釋放并均勻分布。
液體樣品需充分搖勻，避免微生物沉降或聚集。
3、去除干擾因素
對于含抑菌成分的樣品（如食品中的防腐劑、化妝品中的抗菌劑、臨床樣品中的抗生素），需通過稀釋法、中和法、過濾法消除抑菌作用。
中和劑需驗證有效性（如用對應抑菌劑的中和劑，且中和劑本身不影響微生物生長）。
4、稀釋梯度合理
根據樣品污染程度預估，制備系列稀釋液（通常為 10−1~10−6梯度），確保最終接種的平板菌落數在 30~300 CFU 范圍內，符合計數要求。
二、不同類型樣品的準備流程
1、液體樣品（飲用水、飲料、培養(yǎng)液、臨床體液等）
（1）無抑菌成分的澄清液體
搖勻樣品：將液體樣品充分顛倒搖勻（至少 20 次），避免微生物附著容器壁或沉降。
梯度稀釋
取 1 mL 原液 加入含 9 mL 無菌生理鹽水/磷酸鹽緩沖液（PBS）的試管中，渦旋振蕩 30 s，制成 10−1稀釋液。
按同樣方法，從 10−1稀釋液中取 1 mL 加入 9 mL 無菌稀釋液，依次制備更高梯度稀釋液，每次稀釋需更換無菌吸管/槍頭。
特殊處理：若液體樣品渾濁（如污水、果汁），需增加稀釋梯度，避免菌落重疊無法計數。
（2）含抑菌成分的液體
采用中和稀釋法：在無菌稀釋液中加入對應中和劑，再進行梯度稀釋。
驗證中和效果：設置中和劑對照組，確認中和劑無抑菌性。
2、固體樣品（食品、土壤、糞便、固體培養(yǎng)基等）
（1）均質法（適用于大多數固體樣品，如肉類、蔬菜、奶粉）
稱取樣品：用無菌天平稱取 25 g 樣品，放入含 225 mL 無菌生理鹽水/ PBS 的均質袋中（稀釋比例 1:10，即 10−1稀釋液）。
均質處理：將均質袋放入拍擊式均質器中，設置頻率 1000~1500 次/min，均質 1~2 min；無均質器時，可用無菌研磨缽研磨后轉移至稀釋液中，充分振蕩。
梯度稀釋：待均質液靜置 1 min（避免大顆?；|干擾），取上清液按液體樣品方法制備更高梯度稀釋液。
（2）研磨法（適用于堅硬固體，如土壤、植物組織）
稱取 10 g 樣品放入無菌研磨缽，加入少量無菌石英砂和 10 mL 無菌稀釋液。
用無菌研磨棒充分研磨至樣品呈糊狀，轉移至含 80 mL 無菌稀釋液的三角瓶中，振蕩 30 min，制成 10−1稀釋液。
后續(xù)梯度稀釋同前。
3、半固體樣品（奶油、果醬、凝膠狀食品等）
稱取 25 g 樣品，加入 225 mL 預熱至 40~45℃ 的無菌稀釋液（降低樣品黏度），充分攪拌溶解。
若樣品仍有結塊，可通過無菌紗布過濾（紗布需滅菌），取濾液進行梯度稀釋。
三、特殊樣品的預處理方法
1、含油脂樣品（如食用油、油炸食品）
加入吐溫 - 80（終濃度 0.5%~1%）作為乳化劑，幫助油脂分散，避免包裹微生物。
2、干燥樣品（如奶粉、面粉）
采用逐步稀釋法：先將樣品少量多次加入稀釋液中，邊加邊攪拌，防止結塊。
3、臨床樣品（如痰液、傷口分泌物）
痰液需加入 4% 氫氧化鈉溶液 液化處理（1:1 混合，室溫放置 15 min），再中和后稀釋；分泌物直接用無菌生理鹽水稀釋后涂布。
四、樣品準備的質量控制
空白對照：設置稀釋液空白（取 1 mL 無菌稀釋液接種平板）和操作空白（模擬樣品處理流程但不加樣品），確認無外源污染。
稀釋液驗證：稀釋液需無菌、pH 值適宜（通常 7.0~7.2），且不含有抑菌或促菌成分。
平行樣設置：同一稀釋梯度至少制備 2 個平行平板，減少實驗誤差。
時效性：樣品制備后需在 30 min 內 完成接種，避免微生物在稀釋液中死亡或繁殖。
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