厭氧菌的篩選和鑒定方法之分離到確證的完整技術體系！
小楊 / 2025-11-21 10:37:11
厭氧菌的篩選與鑒定是微生物學研究、臨床診斷、工業(yè)應用的核心環(huán)節(jié)，需遵循“選擇性分離→純化→表型鑒定→分子確證”的邏輯流程，核心目標是從復雜樣品（如土壤、糞便、臨床標本）中分離目標厭氧菌，并通過多維度特征驗證其物種身份。以下是結構化、可操作的技術體系，涵蓋原理、步驟、關鍵要點及質量控制。
一、厭氧菌的篩選方法（從樣品到純培養(yǎng)）
篩選的核心是抑制雜菌（尤其是需氧菌、兼性厭氧菌）生長，富集目標厭氧菌，依賴選擇性培養(yǎng)基、無氧環(huán)境及樣品預處理技術。
（一）樣品預處理（提高目標菌檢出率）
根據(jù)樣品類型（如糞便、土壤、臨床膿液）選擇預處理方法，減少雜菌干擾并激活厭氧菌：
樣品類型 預處理方法 原理與目的 操作細節(jié)
糞便、土壤 梯度稀釋 + 熱休克 熱休克（80℃，10 min）殺死不耐熱雜菌，富集芽孢厭氧菌 1.樣品按 1:10 梯度稀釋；2.取稀釋液 80℃水浴 10 min，迅速冷卻后接種
臨床標本（膿液、組織） 研磨均質化 + 抗生素處理（可選） 抗生素抑制革蘭氏陰性雜菌，富集目標厭氧菌 1.組織塊無菌研磨，加入無氧生理鹽水制成懸液；2.加入特定抗生素，室溫孵育 30 min
污水、沉積物 離心富集 + 去氧處理 離心濃縮細菌，去除樣品中溶解氧 1.8000 r/min 離心 10 min，收集沉淀；2.沉淀用含半胱氨酸的無氧生理鹽水重懸
（二）選擇性培養(yǎng)基篩選（核心手段）
通過添加抑制劑、特殊底物或營養(yǎng)成分，實現(xiàn)“抑制雜菌 + 促進目標厭氧菌生長”，常用培養(yǎng)基及應用場景如下：
培養(yǎng)基名稱 核心成分與抑制劑 適用菌株 篩選原理
強化梭菌培養(yǎng)基（RCM） 蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、半胱氨酸 梭菌屬 高營養(yǎng)成分滿足梭菌生長，半胱氨酸維持還原環(huán)境
雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基（BSM） 乳糖、酵母提取物、萬古霉素、鋰鹽 雙歧桿菌屬 雙歧桿菌可利用乳糖，萬古霉素和鋰鹽抑制其他厭氧菌
擬桿菌選擇性培養(yǎng)基（BBE） 膽汁鹽、七葉苷、檸檬酸鐵銨、萬古霉素 擬桿菌屬 膽汁鹽耐受擬桿菌生長，七葉苷水解產(chǎn)生黑色沉淀
產(chǎn)甲烷菌培養(yǎng)基（DSMZ 120） 乙酸、微量元素 產(chǎn)甲烷菌 提供產(chǎn)甲烷菌專屬碳源和還原環(huán)境，抑制非產(chǎn)甲烷菌
厭氧菌血瓊脂（ABA） 哥倫比亞瓊脂、羊血、萬古霉素 + 多粘菌素 臨床厭氧菌 血瓊脂支持營養(yǎng)需求，雙抗抑制需氧菌和革蘭氏陰性雜菌
篩選操作步驟：
培養(yǎng)基制備：按配方配置后，加入還原劑，高壓滅菌（121℃，15 min）；
無氧處理：培養(yǎng)基冷卻至 50℃時，通入無氧氣體（N?/CO?/H?=85:10:5）驅除溶解氧，倒平板（或分裝試管）；
接種：將預處理后的樣品接種到選擇性培養(yǎng)基（固體平板采用涂布法/劃線法，液體培養(yǎng)基采用傾注法）；
厭氧培養(yǎng)：置于厭氧罐/手套箱中，按菌株最適溫度培養(yǎng)（37℃ for 臨床厭氧菌，28℃ for 環(huán)境厭氧菌），培養(yǎng) 24~72 h（嚴格厭氧菌需 5~7 天）；
挑取候選菌落：選擇符合目標菌株形態(tài)特征的菌落，進行純化培養(yǎng)（劃線分離 2~3 代，獲得純培養(yǎng)）。
（三）無氧環(huán)境下的篩選輔助技術
溶血試驗篩選：在血瓊脂平板上，厭氧菌（如
產(chǎn)氣莢膜梭菌）可產(chǎn)生溶血素，形成 α- 溶血（不完全溶血）或 β- 溶血（完全溶血），可作為初步篩選依據(jù)；
色素產(chǎn)生篩選：部分厭氧菌在血瓊脂上培養(yǎng)后，菌落會產(chǎn)生黑色素（黑色或棕色），可直接識別；
氣體產(chǎn)生篩選：液體培養(yǎng)基中加入 Durham 管，厭氧菌發(fā)酵營養(yǎng)物質產(chǎn)生氣體（如 CO?、H?），可觀察到 Durham 管內有氣泡，作為生長陽性指標。
二、厭氧菌的鑒定方法（從表型到分子確證）
鑒定的核心是通過“表型特征 + 分子特征”雙重驗證，確保物種鑒定的準確性。按鑒定層次可分為初級鑒定（表型）和高級鑒定（分子 + 生化）。
（一）初級鑒定：表型特征分析（快速初步歸類）
通過形態(tài)學、生理生化特征，對厭氧菌進行屬水平初步鑒定，適用于大規(guī)模篩選或資源普查。
1、形態(tài)學鑒定
菌落形態(tài)觀察：記錄菌落大小、形狀、顏色、邊緣、隆起度、溶血情況（血瓊脂平板）；
細胞形態(tài)與染色：
革蘭氏染色：厭氧菌多為革蘭氏陽性（如
梭菌、
雙歧桿菌）或革蘭氏陰性（如
擬桿菌、
梭桿菌），需注意：革蘭氏陰性厭氧菌染色時避免脫色過度（用 95% 乙醇脫色 10~15 s）；
顯微鏡觀察：用相差顯微鏡或暗視野顯微鏡觀察活細胞形態(tài)（避免染色導致細胞損傷）。
2、生理生化特征鑒定
通過檢測厭氧菌對營養(yǎng)物質的利用能力、代謝產(chǎn)物類型，實現(xiàn)屬/種水平鑒定，常用方法如下：
鑒定項目 檢測方法 結果判斷與意義 適用菌株
碳源利用試驗 基礎培養(yǎng)基（含指示劑溴甲酚紫）中添加不同碳源 細菌利用碳源產(chǎn)酸，培養(yǎng)基由紫變黃為陽性；可區(qū)分不同種 雙歧桿菌、乳酸菌、擬桿菌
糖發(fā)酵試驗 API 20A 試劑盒（厭氧菌專用） 試劑盒含 20 種生化反應，通過反應模式與數(shù)據(jù)庫比對鑒定 臨床厭氧菌（如
脆弱擬桿菌、
消化鏈球菌）
酶活性檢測 觸酶試驗、氧化酶試驗、脲酶試驗、明膠液化試驗 觸酶試驗：產(chǎn)氣為陽性；脲酶試驗：培養(yǎng)基變紅為陽性 所有厭氧菌（用于排除雜菌和初步歸類）
代謝產(chǎn)物分析（VFA 檢測） 氣相色譜法（GC）檢測發(fā)酵液中揮發(fā)性脂肪酸 不同厭氧菌代謝產(chǎn)物譜不同 腸道厭氧菌、環(huán)境厭氧菌
膽汁耐受試驗 培養(yǎng)基中添加 0.1%~0.5% 膽汁鹽 能生長為陽性 區(qū)分腸道厭氧菌與非腸道厭氧菌
操作要點：
所有生化試驗需在無氧環(huán)境下進行，避免氧氣影響酶活性；
培養(yǎng)基需添加還原劑，維持還原環(huán)境；
結果判斷需結合陽性對照和陰性對照（空白培養(yǎng)基）。
（二）高級鑒定：分子生物學方法（精準確證）
針對表型鑒定難以區(qū)分的菌株，通過分析遺傳物質（DNA/RNA）實現(xiàn)種水平精準鑒定，是目前最可靠的鑒定手段。
1、16S rRNA 基因測序（金標準方法）
原理：16S rRNA 基因是細菌的“分子身份證”，保守區(qū)序列用于屬水平鑒定，可變區(qū)序列用于種水平區(qū)分，通過測序結果與 NCBI、EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫比對，確定物種身份。
操作步驟：
基因組 DNA 提?。翰捎脜捬蹙鷮Ｓ?DNA 提取試劑盒，避免氧氣暴露導致 DNA 降解；
16S rRNA 基因擴增：使用厭氧菌特異性引物，PCR 反應體系需添加 DMSO（5%）提高擴增效率；
測序與比對：PCR 產(chǎn)物純化后進行 Sanger 測序（純培養(yǎng)菌株）或高通量測序（混合菌株），測序結果與數(shù)據(jù)庫比對，相似度≥97% 為同屬，≥99% 為同種。
優(yōu)勢：精準度高，可鑒定表型難以區(qū)分的菌株；
注意事項：避免 DNA 提取過程中污染（如環(huán)境細菌 DNA），需設置陰性對照。
2、特異性基因擴增（PCR 鑒定）
原理：針對目標菌株的特異性基因設計引物，通過 PCR 擴增判斷是否為目標菌株。
應用場景：快速鑒定特定致病菌。
操作步驟：提取基因組 DNA → 特異性引物 PCR 擴增 → 瓊脂糖凝膠電泳檢測 → 陽性條帶出現(xiàn)即為目標菌株。
3、全基因組測序（WGS）
原理：測定菌株全基因組序列，通過比較基因組分析，ANI≥95% 為同種菌株。
優(yōu)勢：可同時獲得物種鑒定、功能基因、毒力基因、耐藥基因等信息，適用于菌株分型、進化分析；
應用場景：科研領域的精準鑒定、臨床耐藥菌株溯源、工業(yè)菌株篩選。
4、其他分子方法
限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）：通過限制性內切酶切割 16S rRNA 基因擴增產(chǎn)物，不同菌株酶切圖譜不同，用于菌株分型；
實時熒光定量 PCR（qPCR）：可同時實現(xiàn)鑒定與定量，適用于樣品中目標厭氧菌的快速檢測。
（三）表型與分子結合的鑒定流程（推薦方案）
純培養(yǎng)菌株 → 形態(tài)學觀察（革蘭氏染色、菌落形態(tài)）→ 觸酶試驗（排除需氧菌雜菌）；
生化鑒定（API 20A 試劑盒或碳源利用試驗）→ 初步歸類至屬/種；
分子確證（16S rRNA 基因測序）→ 與數(shù)據(jù)庫比對，確定物種身份；
特殊需求（如致病菌鑒定）→ 特異性基因 PCR 或 WGS 分析 → 驗證毒力/耐藥特征。
三、關鍵技術要點與質量控制（提高鑒定準確性）
1、純培養(yǎng)質量控制
篩選后需通過劃線分離 2~3 代，確保菌落形態(tài)均一（純培養(yǎng)），避免混合菌株導致鑒定結果偏差；
純培養(yǎng)菌株需在厭氧環(huán)境下短期保藏（如 4℃ 厭氧罐保存，1 周內完成鑒定），避免菌株活力下降或表型改變。
2、試劑與設備質量控制
生化試劑盒需在有效期內使用，嚴格按說明書操作，設置陽性/陰性對照；
分子生物學實驗中，PCR 反應需設置空白對照（無模板）和陽性對照（標準菌株 DNA），避免假陽性/假陰性。
3、結果驗證與重復
表型鑒定結果與分子鑒定結果需相互驗證，若出現(xiàn)矛盾（如表型歸類為梭菌屬，16S 測序為雙歧桿菌屬），需重新提取 DNA 測序或重復生化試驗；
關鍵菌株（如臨床致病菌、工業(yè)生產(chǎn)菌株）需進行至少 2 次獨立鑒定，確保結果可靠。
4、避免雜菌干擾
樣品預處理和接種過程需嚴格無菌操作，避免需氧菌/兼性厭氧菌污染；
若鑒定過程中發(fā)現(xiàn)雜菌（如菌落形態(tài)不一致、觸酶試驗陽性），需重新篩選純化。
四、常見問題與解決方案
問題類型 可能原因 解決方案
篩選后無目標菌落生長 1.無氧環(huán)境構建失?。?.選擇性培養(yǎng)基抑制劑濃度過高；3.樣品中目標菌含量低 1.檢查厭氧指示劑，更換產(chǎn)氣包/手套箱氣體；2.降低抑制劑濃度；3.增加樣品接種量，延長培養(yǎng)時間
生化試驗結果模糊 1.菌株活力不足；2.培養(yǎng)時間不足；3.氧氣影響酶活性 1.復蘇菌株（活化 1~2 代）；2.延長培養(yǎng)時間；3.在厭氧手套箱內進行接種和結果判讀
表型與分子鑒定結果矛盾 1.菌株表型變異；2.測序錯誤；3.生化試驗操作失誤 1.重復表型鑒定（更換批次培養(yǎng)基）；2.重新測序驗證；3.嚴格按試劑盒說明書操作，設置對照
五、應用場景與技術選擇
應用場景 推薦鑒定方法組合 核心需求與優(yōu)勢
臨床診斷 形態(tài)學 + API 20A 生化鑒定 + 特異性基因 PCR 快速準確，可同時鑒定致病菌和毒力基因
科研資源普查 形態(tài)學 + 16S rRNA 基因測序 高通量，可實現(xiàn)屬/種水平精準鑒定
工業(yè)益生菌篩選 形態(tài)學 + 碳源利用試驗 + 16S rRNA 測序 + VFA 代謝分析 兼顧物種鑒定和功能驗證
新物種發(fā)現(xiàn)與命名 形態(tài)學 + 多相分類（生化 + 16S rRNA 測序 + WGS+DNA-DNA 雜交） 滿足國際細菌命名標準，確保分類地位準確
六、技術發(fā)展趨勢
隨著微生物組學和分子生物學技術的進步，厭氧菌鑒定正向快速化、高通量、精準化方向發(fā)展：
微流控技術：實現(xiàn)“篩選 - 鑒定 - 定量”一體化，單次可檢測數(shù)百個菌株；
宏基因組測序：無需純培養(yǎng)，直接從樣品中鑒定厭氧菌物種組成（適用于復雜樣品如腸道微生物組）；
AI 輔助鑒定：通過機器學習算法分析菌落形態(tài)、生化反應模式，快速匹配物種信息；
便攜式檢測設備：適用于現(xiàn)場快速鑒定（如臨床床旁檢測、環(huán)境監(jiān)測）。
綜上，
厭氧菌的篩選與鑒定需結合樣品特性、目標菌株類型及應用需求，選擇“選擇性篩選 + 表型初步鑒定 + 分子精準確證”的組合方案，同時嚴格控制實驗流程的質量，確保結果可靠、可重復。
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