植原體菌種保藏技術(shù)規(guī)程的原理與方法及要求有哪些？
小楊 / 2025-10-30 09:14:37
百歐博偉生物：植原體菌種保藏技術(shù)規(guī)程主要包括保藏原理、保藏方法、技術(shù)要求等方面，以下是詳細(xì)介紹：
一、范圍
規(guī)定了植原體菌種保藏的基本原則、方法及技術(shù)要求，適用于各類(lèi)植原體菌種的保藏。
二、術(shù)語(yǔ)與定義
植原體是指寄生于植物韌皮部和介體昆蟲(chóng)體內(nèi)的、具有三層單位膜結(jié)構(gòu)的無(wú)細(xì)胞壁的原核生物，一般引起植物葉片黃化和發(fā)育畸形等癥狀。
三、原理
植原體菌種尚不能在離體人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)感染植原體的植物莖段進(jìn)行繁殖，即可達(dá)到對(duì)植原體的繁殖和培養(yǎng)。較低的溫度條件可減緩植物和植原體的代謝活動(dòng)，減少菌株突變，降低繁殖速度，有效保持菌種原有性狀。
四、技術(shù)要求
1、保藏方法：
用組織培養(yǎng)法保藏感染植原體的植物組織，于 5-25℃溫度范圍內(nèi)保藏。
2、植物組織培養(yǎng)基：
選用適于植物組織正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，不含四環(huán)素簇抗生素或其它對(duì)植原體生長(zhǎng)和繁殖有抑制作用的成分。
3、培養(yǎng)溫度和光照：
培養(yǎng)溫度 20-28℃為宜，光照強(qiáng)度在 1000-3000lx，光期為 10-14h/d。
4、保藏溫度和時(shí)間：
常溫保藏（20-28℃），保藏時(shí)間 1-3 個(gè)月；低溫保藏（6-10℃），保藏時(shí)間 6 個(gè)月至 1 年。
5、保藏期檢測(cè)：
定期檢查保藏菌種的房間、冷庫(kù)、冰箱的溫度、濕度，檢查各保藏試管有無(wú)雜菌污染現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)雜菌污染，則取出該管重新移植，培養(yǎng)后補(bǔ)缺。
6、移植復(fù)核：
大量植原體 - 植物共生體進(jìn)行移植時(shí)，各菌株的編號(hào)、所用培養(yǎng)基需仔細(xì)核對(duì)無(wú)誤。每次移植培養(yǎng)后，對(duì)照原保藏的菌株和菌種順序號(hào)卡片名錄，核實(shí)無(wú)誤再行存放。
7、保藏指標(biāo)：
當(dāng)獲得的組培苗表現(xiàn)典型癥狀或在熒光顯微鏡下觀察到特異植原體 DNA 熒光后即可進(jìn)行菌株的保藏。
五、操作方法與步驟
1、帶菌外植體采集：
在田間采集表現(xiàn)典型癥狀的新鮮枝條，剪去葉和嫩梢，經(jīng)酒精和升汞等消毒劑表面消毒后，截成具節(jié)莖段，移入培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
2、無(wú)雜菌組培苗的獲得：
外植體長(zhǎng)出新枝后，選無(wú)雜菌感染的外植體，截取新枝，移入新配制的培養(yǎng)基上培養(yǎng)和繁殖。如培養(yǎng)基被雜菌污染，將組培苗再進(jìn)行表面消毒處理，移入新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)操作 2-3 次，直至獲得無(wú)雜菌組培苗為止。
3、組織帶菌鑒定：
用 DAPI 熒光顯微鏡技術(shù)和 PCR 技術(shù)鑒定組織帶菌狀況和濃度。
4、常溫保藏：
植原體 - 植物共生體在適宜的組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并在正常溫度和光照下（20-28℃，光照強(qiáng)度在 1000-3000lx）進(jìn)行保藏，保藏周期為 1-3 個(gè)月。
5、低溫保藏：
將正常溫度和光照下（20-28℃，光照強(qiáng)度在 1000-3000lx）培養(yǎng)的植原體 - 植物共生體移入含組織培養(yǎng)基的試管內(nèi)，移入 6-10℃低溫冷藏柜內(nèi)保藏，1-2 個(gè)月將試管暴露于正常培養(yǎng)溫度和光照條件下補(bǔ)光 2-3 天，然后存放于低溫冷藏柜繼續(xù)保藏，保藏周期為 6 個(gè)月至 1 年以上。
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