微生物藥品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查方法的驗(yàn)證！
小楊 / 2025-09-23 09:57:37
百歐博偉生物：藥品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查方法的驗(yàn)證，是確保該微生物檢查方法能準(zhǔn)確、可靠檢出藥品中微生物污染的關(guān)鍵步驟，核心目的是證明方法在特定藥品基質(zhì)下的適用性，避免因藥品本身抑菌性或其他干擾導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確。
一、驗(yàn)證的核心目的與適用場景
驗(yàn)證并非一次性操作，而是需在特定情況下啟動，確保方法始終有效。
1、核心目的
確認(rèn)方法能有效克服藥品自身的抑菌性，避免漏檢或計(jì)數(shù)偏低。
證明方法的準(zhǔn)確性、精密度、專屬性，確保不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作人員使用時結(jié)果一致。
為藥品的微生物質(zhì)量控制提供可靠的方法學(xué)依據(jù)，符合《中國藥典》《美國藥典》等法規(guī)要求。
2、必須進(jìn)行驗(yàn)證的場景
首次建立某藥品的微生物計(jì)數(shù)方法時。
藥品的處方、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)環(huán)境發(fā)生重大變更，可能影響微生物檢出時。
藥品的包裝材料或儲存條件改變，可能引入新的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)時。
對已有方法的可靠性產(chǎn)生懷疑（如多次檢出結(jié)果異常）時。
法規(guī)或藥典要求更新時。
二、驗(yàn)證的關(guān)鍵項(xiàng)目與操作要點(diǎn)
根據(jù)《中國藥典》2020 年版四部通則 1105（非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法），驗(yàn)證需重點(diǎn)完成以下 5 個項(xiàng)目，且均需設(shè)置陽性對照、陰性對照、供試品對照，排除干擾因素。
1、專屬性（Specificity）：確保僅目標(biāo)微生物被檢出
目的：證明藥品基質(zhì)、稀釋液、培養(yǎng)基等不會抑制目標(biāo)微生物生長，也不會導(dǎo)致非目標(biāo)微生物誤判。
結(jié)果判斷：供試品組的菌落數(shù)與空白對照組的菌落數(shù)差異應(yīng)在 ±20% 以內(nèi)，且菌落形態(tài)與陽性對照一致，無雜菌干擾，即專屬性合格。
2、準(zhǔn)確性（Accuracy）：確保計(jì)數(shù)結(jié)果接近真實(shí)值
目的：衡量方法檢出的微生物數(shù)量與實(shí)際污染數(shù)量的吻合程度，避免因藥品抑菌導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏低。
操作要點(diǎn)：
向“藥品供試品溶液”中加入已知濃度的對照菌株（約 100CFU / 份，CFU 為菌落形成單位），制備 3 份平行樣品。
同時制備“空白對照（僅稀釋液 + 菌株）”和“供試品空白（僅藥品供試品溶液）”。
按方法計(jì)數(shù)后，計(jì)算回收率：回收率 =（供試品組菌落數(shù) - 供試品空白菌落數(shù)）/ 空白對照組菌落數(shù) ×100%。
結(jié)果判斷：細(xì)菌、酵母菌的回收率需在 50%~200% 之間，霉菌回收率需在 40%~200% 之間（因霉菌孢子萌發(fā)較慢，允許范圍更寬）。
3、精密度（Precision）：確保結(jié)果的重復(fù)性與重現(xiàn)性
目的：證明同一操作人員、同一實(shí)驗(yàn)室（重復(fù)性）或不同人員、不同實(shí)驗(yàn)室（重現(xiàn)性）使用該方法時，結(jié)果一致。
操作要點(diǎn)：
重復(fù)性：同一操作人員，在相同儀器、相同條件下，對同一份“含已知菌株的供試品溶液”進(jìn)行至少 6 次平行計(jì)數(shù)，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。
重現(xiàn)性：不同操作人員、不同時間或不同實(shí)驗(yàn)室，對同一樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，RSD 需符合要求。
結(jié)果判斷：重復(fù)性試驗(yàn)的 RSD 應(yīng)≤15%，重現(xiàn)性試驗(yàn)的 RSD 應(yīng)≤25%（微生物計(jì)數(shù)存在天然波動，允許一定偏差）。
4、檢測限（Limit of Detection, LOD）：確保能檢出低濃度污染
目的：確定方法能檢出的最低微生物濃度，尤其適用于“預(yù)計(jì)微生物含量極低”的藥品。
操作要點(diǎn)：
將對照菌株稀釋至極低濃度（如 1~10CFU/mL）。
取該稀釋液加入供試品溶液中，制備至少 5 份平行樣品，按方法培養(yǎng)。
結(jié)果判斷：若≥90% 的樣品能檢出目標(biāo)微生物（即出現(xiàn)菌落），則該濃度為方法的檢測限，需滿足藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。
5、線性與范圍（Linearity and Range）：確保計(jì)數(shù)在有效區(qū)間內(nèi)
目的：證明方法在一定的微生物濃度范圍內(nèi)，計(jì)數(shù)結(jié)果與實(shí)際濃度呈線性關(guān)系，可準(zhǔn)確量化污染程度。
操作要點(diǎn)：
將對照菌株稀釋為 3~5 個濃度梯度（如 10^1、10^2、10^3 CFU/mL）。
每個濃度梯度制備 3 份平行樣品，加入供試品溶液后培養(yǎng)計(jì)數(shù)。
以“實(shí)際濃度的對數(shù)”為橫坐標(biāo)，“計(jì)數(shù)結(jié)果的對數(shù)”為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程（R²）。
結(jié)果判斷：線性回歸系數(shù) R²≥0.98，且每個濃度的回收率符合準(zhǔn)確性要求，即線性合格；該濃度范圍即為方法的有效計(jì)數(shù)范圍。
三、驗(yàn)證中的特殊情況處理
部分藥品（如抗生素、消毒劑、含抑菌成分的中藥）自身具有強(qiáng)抑菌性，直接按上述方法驗(yàn)證會導(dǎo)致回收率極低，需先消除抑菌性，常用方法如下：
稀釋法：將供試品用無菌稀釋液（如 0.9% 氯化鈉溶液、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）稀釋至“抑菌性消失的濃度”（需通過預(yù)試驗(yàn)確定）。
中和法：加入能中和抑菌成分的試劑，如用 β- 內(nèi)酰胺酶中和青霉素類抗生素，用硫代硫酸鈉中和含氯消毒劑。
過濾法：用無菌濾膜（孔徑 0.45μm）過濾供試品溶液，截留微生物后，用無菌稀釋液沖洗濾膜（去除殘留抑菌成分），再將濾膜轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基培養(yǎng)。
培養(yǎng)基稀釋法：將供試品溶液分多次加入同一培養(yǎng)基中，降低單位體積內(nèi)的抑菌成分濃度。
四、驗(yàn)證報(bào)告的核心內(nèi)容
驗(yàn)證完成后需撰寫正式報(bào)告，確?？勺匪菪裕瑘?bào)告應(yīng)包含以下內(nèi)容：
藥品基本信息：名稱、規(guī)格、批號、生產(chǎn)工藝、處方（尤其是否含抑菌成分）。
驗(yàn)證依據(jù)：引用的藥典通則、企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
儀器與試劑：培養(yǎng)箱、無菌操作臺、培養(yǎng)基、對照菌株的來源與批號。
驗(yàn)證方法：詳細(xì)描述每個驗(yàn)證項(xiàng)目的操作步驟（如稀釋梯度、培養(yǎng)條件）、對照設(shè)置。
原始數(shù)據(jù)：各平行樣品的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果、回收率計(jì)算過程、線性回歸方程等。
結(jié)果判斷：逐一判斷每個驗(yàn)證項(xiàng)目是否合格，明確是否需消除抑菌性及方法。
結(jié)論：總結(jié)該方法是否適用于該藥品的微生物計(jì)數(shù)，若不合格，需提出改進(jìn)方案（如調(diào)整稀釋倍數(shù)、更換中和劑）。
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