微生物檢測中，對培養(yǎng)基的無菌操作有哪些具體要求？
小楊 / 2025-09-15 09:43:30
百歐博偉生物：在微生物檢測中，培養(yǎng)基作為微生物生長繁殖的營養(yǎng)基礎(chǔ)，其無菌性直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性（如避免假陽性、確保目標(biāo)菌正常生長）。對培養(yǎng)基的無菌操作需貫穿制備、滅菌、儲存、使用全流程，具體要求如下：
一、培養(yǎng)基制備過程的無菌要求
1、原料與器具清潔
培養(yǎng)基原料（如蛋白胨、瓊脂、鹽類等）需符合純度標(biāo)準(zhǔn)，避免引入雜菌；稱量時使用清潔、干燥的無菌容器（如滅菌燒杯），避免原料被環(huán)境微生物污染。
制備用玻璃器皿（燒杯、玻璃棒、漏斗等）需提前滅菌（高壓蒸汽滅菌或干熱滅菌），或用 75% 酒精徹底擦拭后晾干，防止殘留微生物污染培養(yǎng)基。
2、溶解與分裝規(guī)范
溶解培養(yǎng)基時，攪拌工具需無菌（如滅菌玻璃棒），避免接觸非無菌表面；加熱溶解過程中，容器口需覆蓋無菌紗布，防止空氣中微生物落入。
分裝至試管或錐形瓶時，需在超凈工作臺內(nèi)操作，容器口靠近酒精燈火焰，避免液體濺出污染瓶口；分裝量不宜過多（如試管不超過 1/3 容積），方便后續(xù)滅菌和使用。
二、培養(yǎng)基滅菌的核心要求
1、滅菌方法選擇
大多數(shù)培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌：121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²）條件下維持 20-30 分鐘（含升溫至設(shè)定溫度的時間），確保殺滅包括芽孢在內(nèi)的所有微生物。
對熱敏感的培養(yǎng)基（如含有維生素、抗生素的培養(yǎng)基），需采用過濾滅菌：使用 0.22μm 孔徑的無菌濾膜過濾，去除微生物后分裝至無菌容器。
2、滅菌過程控制
滅菌前需檢查高壓滅菌器的壓力表、溫度表是否正常，確保滅菌參數(shù)準(zhǔn)確；滅菌鍋內(nèi)物品擺放不宜過密，保證蒸汽流通充分。
滅菌結(jié)束后，待壓力降至 0MPa、溫度降至 80℃以下再打開鍋蓋，避免因壓力驟降導(dǎo)致培養(yǎng)基沸騰濺出污染；取出后需立即檢查容器是否破損、封口是否嚴密，如有破損需廢棄。
三、滅菌后培養(yǎng)基的無菌儲存要求
1、暫存與標(biāo)記
滅菌后的培養(yǎng)基需在超凈工作臺內(nèi)冷卻（如倒平板需冷卻至 50-60℃），避免冷卻過程中吸入空氣中的微生物；未立即使用的培養(yǎng)基需密封（如試管加硅膠塞、錐形瓶加無菌棉塞），標(biāo)記名稱、滅菌日期和有效期。
固體培養(yǎng)基（如瓊脂平板）需倒置存放于 4℃冰箱，避免冷凝水滴落污染培養(yǎng)基表面；液體培養(yǎng)基需直立存放，防止瓶口污染。
2、有效期管理
一般滅菌后的培養(yǎng)基有效期為：4℃冷藏條件下 1-2 周（具體根據(jù)培養(yǎng)基類型調(diào)整，如血瓊脂培養(yǎng)基需在 24 小時內(nèi)使用），超過有效期需重新滅菌或廢棄。
使用前需觀察培養(yǎng)基是否變質(zhì)（如渾濁、長菌、顏色異常、出現(xiàn)沉淀），若有異常則判定為污染，禁止使用。
四、培養(yǎng)基使用過程的無菌操作
1、取用規(guī)范
打開培養(yǎng)基容器（如試管、培養(yǎng)皿）時，需在超凈工作臺內(nèi)操作，容器口靠近酒精燈火焰，用手旋轉(zhuǎn)打開蓋子（避免直接拉開導(dǎo)致氣流帶入微生物），取出后立即蓋緊蓋子，減少暴露時間。
倒平板時，培養(yǎng)皿需提前滅菌，打開皿蓋時僅揭開一條縫隙（約 1/3），倒入培養(yǎng)基后迅速蓋緊，輕輕搖勻使培養(yǎng)基均勻分布，待凝固后倒置存放。
2、接種時的防護
接種操作需在超凈工作臺內(nèi)進行，接種環(huán)、移液槍頭等工具需滅菌后使用；滴加或劃線時，避免工具接觸培養(yǎng)基邊緣或皿蓋內(nèi)側(cè)，防止污染。
一次未用完的培養(yǎng)基（如剩余的液體培養(yǎng)基），需在瓶口火焰滅菌后密封，標(biāo)記剩余量和使用日期，冷藏保存并盡快用完（一般不超過 24 小時）。
五、培養(yǎng)基無菌性驗證要求
每批次滅菌后的培養(yǎng)基需進行無菌檢查：取少量培養(yǎng)基（如 10-20mL 液體培養(yǎng)基或 1-2 個平板），在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24-48 小時，觀察是否有菌落生長。
若無菌檢查發(fā)現(xiàn)污染，需立即排查滅菌過程（如參數(shù)是否達標(biāo)、滅菌器是否故障）、儲存環(huán)境或操作環(huán)節(jié)的問題，廢棄該批次培養(yǎng)基并重新制備。
通過嚴格執(zhí)行以上操作，可確保培養(yǎng)基在整個生命周期內(nèi)保持無菌狀態(tài)，為微生物檢測提供可靠的營養(yǎng)環(huán)境，避免因培養(yǎng)基污染導(dǎo)致檢測結(jié)果失真。
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