細(xì)菌芽胞染色的原理與常用方法及應(yīng)用場景與結(jié)果判定！
小楊 / 2025-09-04 09:48:14
百歐博偉生物：細(xì)菌的芽胞染色是微生物學(xué)中用于區(qū)分細(xì)菌營養(yǎng)體與芽胞的特殊染色技術(shù)，其核心原理是利用芽胞具有堅韌的芽孢壁（含大量肽聚糖和吡啶二羧酸鈣，對染料親和力低、抗?jié)B透性強），需通過特殊處理（如加熱）使染料進入芽胞，再經(jīng)脫色步驟保留芽胞顏色，最終實現(xiàn)營養(yǎng)體與芽胞的顏色差異，便于顯微鏡觀察。
一、染色原理
芽胞的結(jié)構(gòu)特點決定了常規(guī)染色難以著色：
芽胞的抗染性：芽胞壁致密且含吡啶二羧酸鈣，普通染料（如結(jié)晶紫、美藍）無法直接穿透，需通過加熱（或延長染色時間） 破壞芽胞壁的通透性，使染料（如孔雀綠）進入并與芽胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)合。
脫色的選擇性：染色后用蒸餾水（或自來水）脫色時，營養(yǎng)體的細(xì)胞壁通透性高，結(jié)合的染料易被洗脫；而芽胞內(nèi)的染料與 DPA-Ca 等物質(zhì)結(jié)合緊密，不易被脫色，仍保留原色（如孔雀綠的綠色）。
復(fù)染的對比性：最后用復(fù)染劑（如番紅）對營養(yǎng)體進行染色，使其呈現(xiàn)與芽胞不同的顏色（如番紅的紅色），最終在顯微鏡下可清晰區(qū)分“綠色芽胞”與“紅色營養(yǎng)體”。
二、常用染色方法
微生物實驗室中最經(jīng)典、最常用的是孔雀綠 - 番紅染色法，操作步驟簡單且效果穩(wěn)定，具體流程如下：
步驟 操作細(xì)節(jié) 目的 時長/條件
涂片制備 取含芽胞的細(xì)菌培養(yǎng)物，在載玻片中央加 1 滴生理鹽水，將菌苔研磨均勻，涂成薄而均勻的菌膜 保證細(xì)菌分散，避免重疊，便于觀察 涂片后自然晾干
固定 將晾干的載玻片通過酒精燈外焰快速過 3 次 殺死細(xì)菌，使菌體黏附在載玻片上，防止染色時脫落 過焰時以載玻片不燙手為宜
初染 滴加孔雀綠染液覆蓋整個菌膜，將載玻片置于石棉網(wǎng)上，用小火緩慢加熱至染液微冒蒸汽，期間不斷補充染液 加熱破壞芽胞壁通透性，使孔雀綠進入芽胞并結(jié)合 維持微沸狀態(tài) 5-10min
脫色 待載玻片冷卻后，用蒸餾水緩慢沖洗至流出液無綠色 洗脫營養(yǎng)體上未結(jié)合的孔雀綠，保留芽胞內(nèi)的綠色 沖洗至流出液澄清即可
復(fù)染 滴加番紅染液覆蓋菌膜，室溫下靜置 使脫色后的營養(yǎng)體著色，與芽胞形成顏色對比 3-5min
干燥與觀察 傾去番紅染液，用吸水紙輕輕吸干載玻片表面水分，置于光學(xué)顯微鏡下，用油鏡觀察 去除多余染液，清晰觀察染色結(jié)果 油鏡觀察時需滴加香柏油
三、預(yù)期染色結(jié)果
通過孔雀綠 - 番紅染色后，顯微鏡下可觀察到兩種不同顏色的結(jié)構(gòu)，具體判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
營養(yǎng)體（未形成芽胞的細(xì)菌）：呈紅色，形態(tài)為細(xì)菌的典型形態(tài)（如
枯草芽孢桿菌為桿狀）；
若細(xì)菌處于“芽胞形成過程中”，可能觀察到“菌體紅色、內(nèi)部含綠色芽胞”的過渡狀態(tài)。
四、關(guān)鍵注意事項
菌齡選擇：芽胞的形成需要一定時間（如
枯草芽孢桿菌需培養(yǎng) 48-72h，
破傷風(fēng)梭菌需厭氧培養(yǎng) 5-7 天），若菌齡過短（僅對數(shù)期營養(yǎng)體），則無芽胞形成，染色結(jié)果無效。
加熱控制：初染時需用小火緩慢加熱，避免染液沸騰（導(dǎo)致菌膜焦化）或干涸（染料結(jié)晶影響觀察），若染液減少需及時補充。
脫色適度：脫色時用蒸餾水緩慢沖洗，不可用酒精（酒精會破壞芽胞結(jié)構(gòu)），且沖洗時間不宜過長（防止芽胞內(nèi)染料被過度洗脫）。
安全操作：加熱時需在石棉網(wǎng)上進行，避免載玻片直接接觸火焰導(dǎo)致破裂；使用油鏡后需用擦鏡紙蘸二甲苯清潔鏡頭。
五、應(yīng)用場景
芽胞染色主要用于鑒別產(chǎn)芽胞細(xì)菌，尤其是在醫(yī)學(xué)和食品微生物學(xué)中具有重要意義：
食品衛(wèi)生：檢測食品中是否存在耐高溫的芽胞菌（如
蠟樣芽孢桿菌，可引起食物中毒），評估食品加工的滅菌效果；
微生物分類：根據(jù)芽胞的形態(tài)、位置等特征，輔助細(xì)菌的屬、種鑒定（如梭菌屬芽胞多為末端或次末端，芽孢桿菌屬芽胞多為中央）。
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