指示菌和指標(biāo)菌的檢測與計(jì)數(shù)是保障公共衛(wèi)生和環(huán)境安全的關(guān)鍵！
小楊 / 2025-06-24 09:55:42
百歐博偉生物：指示菌（indicator organisms）和指標(biāo)菌（index organisms）的檢測與計(jì)數(shù)是環(huán)境微生物學(xué)、食品微生物學(xué)和水質(zhì)監(jiān)測中的核心任務(wù)。它們用于間接評(píng)估樣品的衛(wèi)生狀況、糞便污染風(fēng)險(xiǎn)或潛在病原體存在的可能性。
一、核心概念區(qū)分
1、指示菌：
定義：通常指一大類本身通常不致?。ɑ蛑虏⌒院艿停?，但其存在或數(shù)量能反映樣品受糞便污染程度、整體衛(wèi)生狀況或消毒效果的微生物。
意義：高數(shù)量通常指示衛(wèi)生條件差、可能存在糞便污染、處理/消毒不徹底，從而提示存在病原體（如
沙門氏菌、
志賀氏菌、病毒、寄生蟲）的風(fēng)險(xiǎn)較高。它們更容易、更快速、更安全地被檢測。
2、指標(biāo)菌：
定義：特指那些直接與特定病原體相關(guān)聯(lián)，其存在明確指示該病原體可能存在的微生物。有時(shí)與“指示菌”混用，但更強(qiáng)調(diào)與病原體的直接聯(lián)系。
代表：
大腸桿菌 (Escherichia coli)：常被視為糞便污染最特異的指標(biāo)菌（屬于糞大腸菌群）。其存在強(qiáng)烈提示近期糞便污染和存在腸道病原體的風(fēng)險(xiǎn)。
腸道病毒：可作為人類腸道病毒污染的指標(biāo)。
特定基因標(biāo)記：分子生物學(xué)方法檢測的特定遺傳標(biāo)記，能更特異地指示人類糞便污染源。
意義：提供比一般指示菌更具體、更直接的污染來源和風(fēng)險(xiǎn)信息。
二、常用檢測與計(jì)數(shù)方法
檢測和計(jì)數(shù)通常遵循標(biāo)準(zhǔn)方法（《水和廢水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》、ISO標(biāo)準(zhǔn)、FDA《細(xì)菌學(xué)分析手冊(cè)》、國家標(biāo)準(zhǔn)如GB系列等）。主要分為培養(yǎng)法、酶底物法、分子生物學(xué)方法和快速檢測法。
1、培養(yǎng)法 (最常用，是金標(biāo)準(zhǔn)或參考方法)
原理：利用目標(biāo)菌的生理生化特性（如發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、耐熱性、特定酶活性），在選擇性培養(yǎng)基上生長形成可見菌落或引起培養(yǎng)基顏色/狀態(tài)變化。
主要計(jì)數(shù)方法：
a.多管發(fā)酵法：
原理：將樣品進(jìn)行一系列稀釋，每個(gè)稀釋度接種多管（通常5管或10管）含選擇性液體培養(yǎng)基的試管中。
過程：根據(jù)目標(biāo)菌特性進(jìn)行初發(fā)酵（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）、復(fù)發(fā)酵確認(rèn)、完成鑒定試驗(yàn)。
計(jì)數(shù)：根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理（MPN表），統(tǒng)計(jì)陽性管數(shù)（產(chǎn)酸產(chǎn)氣的管數(shù)），查最可能數(shù)表得到樣品的MPN值（Most Probable Number，最可能數(shù)/100mL或g）。單位通常是MPN/100mL或MPN/g。
優(yōu)點(diǎn)：適用于濁度高、含顆粒物或菌量較低的樣品（如水、淤泥、某些食品）。靈敏度相對(duì)較高。
缺點(diǎn)：耗時(shí)長（通常24-72小時(shí)甚至更長）、工作量大、耗費(fèi)材料多、結(jié)果是統(tǒng)計(jì)學(xué)估計(jì)值而非精確計(jì)數(shù)。
b.濾膜法：
原理：將一定體積的樣品通過孔徑為0.45μm的濾膜過濾，細(xì)菌被截留在膜表面。將濾膜貼在選擇性固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
計(jì)數(shù)：培養(yǎng)后，直接計(jì)數(shù)濾膜上生長的具有目標(biāo)菌特征形態(tài)（如金屬光澤）的菌落數(shù)。
計(jì)算：菌落數(shù) / 過濾樣品體積 = CFU (Colony Forming Units, 菌落形成單位) / 100mL 或 /g。
優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果直接（CFU）、相對(duì)快速（通常24-48小時(shí)）、可處理較大體積樣品提高靈敏度、節(jié)省培養(yǎng)基。
缺點(diǎn)：不適用于渾濁度高、含大量懸浮物或雜菌過多的樣品（會(huì)堵塞濾膜或干擾計(jì)數(shù)）。需要無菌操作和過濾裝置。
應(yīng)用：清潔水體（如飲用水、地表水、游泳池水）中的總大腸菌群、大腸桿菌、腸球菌的檢測計(jì)數(shù)。
c.平板涂布/傾注法：
原理：將樣品或稀釋液涂布在選擇性固體培養(yǎng)基表面，或與熔化的培養(yǎng)基混合傾注平板。
計(jì)數(shù)：培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)平板上具有目標(biāo)菌特征形態(tài)的菌落。
計(jì)算：菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) / 接種體積 = CFU / mL 或 /g。
優(yōu)點(diǎn)：操作相對(duì)簡單，結(jié)果直觀（CFU）。
缺點(diǎn)：通常適用于菌量適中且雜質(zhì)較少的樣品（如食品勻漿液）。靈敏度受接種體積限制（通常≤1mL）。
應(yīng)用：食品、土壤等樣品中腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等的計(jì)數(shù)；也用于大腸菌群/大腸桿菌的確認(rèn)試驗(yàn)。
2、酶底物法 (Defined Substrate Technology - DST)
原理：利用目標(biāo)菌特有的酶（如大腸桿菌的β-葡萄糖醛酸酶分解MUG產(chǎn)生熒光；總大腸菌群的β-半乳糖苷酶分解ONPG使培養(yǎng)基變黃）來檢測。底物與營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合在單一培養(yǎng)基或試劑中。
代表方法：
Colilert® / Quanti-Tray® 系統(tǒng)：
將樣品加入含特定酶底物的試劑中。
混合溶解后，倒入特制的多孔定量盤中，密封培養(yǎng)。
計(jì)數(shù)：
總大腸菌群陽性孔：孔內(nèi)液體變黃（產(chǎn)β-半乳糖苷酶）。
大腸桿菌陽性孔：孔內(nèi)液體在紫外燈下顯熒光（產(chǎn)β-葡萄糖醛酸酶）。
根據(jù)陽性孔的數(shù)量查專用的MPN表得到結(jié)果（MPN/100mL）。
優(yōu)點(diǎn)：非常快速（通常18-24小時(shí)出結(jié)果）、操作簡便（只需加樣、溶解、倒入定量盤）、特異性好（尤其區(qū)分大腸桿菌）、結(jié)果判讀客觀（顏色/熒光）、可同時(shí)檢測總大腸菌群和大腸桿菌。
缺點(diǎn)：成本相對(duì)較高（試劑和定量盤），定量盤需要專用封口設(shè)備，通常適用于液體樣品（水）。
應(yīng)用：水質(zhì)（特別是飲用水和娛樂用水）中總大腸菌群和大腸桿菌的快速檢測計(jì)數(shù)（MPN）。類似原理也用于腸球菌檢測。
3、分子生物學(xué)方法 (快速、高特異性和靈敏度)
原理：檢測目標(biāo)菌的特異性基因片段（DNA或RNA）。
主要技術(shù)：
PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：定性檢測目標(biāo)菌是否存在。也可結(jié)合凝膠電泳或探針雜交。
qPCR/實(shí)時(shí)熒光定量PCR：最重要和最常用的定量分子方法。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針或染料，實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物量，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線精確定量目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。結(jié)果通常報(bào)告為基因拷貝數(shù) (Gene Copies, GC) / 體積或重量。需要將GC轉(zhuǎn)換為細(xì)胞數(shù)（通常假設(shè)1個(gè)細(xì)胞含1個(gè)靶基因拷貝，但實(shí)際有差異）。
數(shù)字PCR：更精確的絕對(duì)定量方法，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接將反應(yīng)體系分割成數(shù)萬個(gè)微反應(yīng)單元進(jìn)行PCR，統(tǒng)計(jì)陽性單元比例計(jì)算絕對(duì)拷貝數(shù)。精度更高，抗抑制劑能力強(qiáng)，但成本高、通量相對(duì)較低。
測序 (如16S rRNA基因測序、宏基因組測序)：用于復(fù)雜微生物群落中指示/指標(biāo)菌的鑒定和相對(duì)豐度分析，但通常不用于日常定量檢測。
優(yōu)點(diǎn)：極快（幾小時(shí)出結(jié)果）、特異性極高（可區(qū)分到種甚至亞種/血清型）、靈敏度極高（可檢測不可培養(yǎng)或受損的細(xì)菌）、可自動(dòng)化高通量檢測。
缺點(diǎn)：成本高（儀器、試劑）、需要專業(yè)人員和實(shí)驗(yàn)室、無法區(qū)分死菌和活菌（除非結(jié)合前處理如PMA/EMA染料或mRNA檢測）、樣品中抑制物可能干擾反應(yīng)、結(jié)果單位（GC）與傳統(tǒng)的CFU/MPN意義不同，需要建立相關(guān)性。
應(yīng)用：水質(zhì)、食品中特定指示菌（如
大腸桿菌、
腸球菌）和指標(biāo)菌的快速篩查和高通量定量檢測；病原體的直接檢測。
4、快速檢測試劑盒/測試片
原理：基于顯色培養(yǎng)基、免疫學(xué)方法（如膠體金側(cè)流層析）或簡易酶底物原理的預(yù)包裝一次性裝置。
代表：3M Petrifilm™測試片（
大腸菌群、
大腸桿菌）、顯色培養(yǎng)基平板、一些免疫層析試紙條。
優(yōu)點(diǎn)：操作極其簡便、快速（通常24-48小時(shí)）、便攜（部分可用于現(xiàn)場）、結(jié)果直觀（顏色變化或菌落顯色）。
缺點(diǎn)：通常為半定量（如按菌落密度分級(jí)）或定性，精確度可能低于標(biāo)準(zhǔn)方法，成本可能較高。
應(yīng)用：食品加工環(huán)境監(jiān)控、現(xiàn)場快速篩查、中小實(shí)驗(yàn)室的日常檢測。
三、方法選擇的關(guān)鍵考慮因素
目標(biāo)微生物：總大腸菌群？大腸桿菌？腸球菌？指標(biāo)菌需要更高特異性的方法（如酶底物法、分子法）。
樣品類型：水？食品？土壤？濁度？含顆粒物？含抑制劑？決定能否用濾膜法、是否需要特殊前處理。
所需信息：定性（有/無）？定量（CFU/MPN/GC）？精確度要求？
時(shí)間和速度要求：常規(guī)監(jiān)測可用培養(yǎng)法；需要快速結(jié)果（如疫情調(diào)查、過程控制）選酶底物法或分子法。
成本和資源：實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、人員技能、預(yù)算。分子法設(shè)備投入大，酶底物法試劑成本高，培養(yǎng)法耗時(shí)長但設(shè)備要求相對(duì)低。
法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)要求：特定領(lǐng)域（如飲用水、食品出口）往往規(guī)定必須使用的標(biāo)準(zhǔn)方法。結(jié)果需有可比性。
死菌 vs 活菌：培養(yǎng)法和酶底物法（基于酶活性）主要檢測活菌；分子法（PCR）檢測DNA，無法區(qū)分死菌活菌，可能高估風(fēng)險(xiǎn)。
四、總結(jié)
指示菌和指標(biāo)菌的檢測與計(jì)數(shù)是保障公共衛(wèi)生和環(huán)境安全的關(guān)鍵。選擇合適的方法需要權(quán)衡目標(biāo)微生物、樣品特性、信息需求、速度、成本和法規(guī)要求。傳統(tǒng)培養(yǎng)法（MPN法、濾膜法、平板法）仍是基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)和參考方法。酶底物法因其快速、簡便和特異性在特定領(lǐng)域（尤其水質(zhì)）廣泛應(yīng)用。分子生物學(xué)方法（特別是qPCR）憑借其超快速度和超高特異性/靈敏度發(fā)展迅速，是未來的重要方向，但成本和對(duì)死菌的檢測是其局限性?？焖贆z測試劑盒/測試片則提供了便捷的現(xiàn)場或篩查選擇。理解各種方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)估微生物風(fēng)險(xiǎn)和做出正確決策至關(guān)重要。
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