實(shí)驗(yàn)室微生物菌種分離純化的具體操作步驟與關(guān)鍵注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-05-28 10:01:19
百歐博偉生物：實(shí)驗(yàn)室中微生物菌種的分離與純化是微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)操作，目的是從混合樣品中獲得單一菌株的純培養(yǎng)。以下是具體步驟及關(guān)鍵注意事項(xiàng)：
一、準(zhǔn)備工作
1、實(shí)驗(yàn)材料：
樣品來(lái)源（土壤、水體、空氣、臨床樣本等）。
培養(yǎng)基（根據(jù)目標(biāo)微生物選擇，如LB培養(yǎng)基用于細(xì)菌，PDA培養(yǎng)基用于真菌）。
滅菌工具：接種環(huán)、涂布棒、移液槍、培養(yǎng)皿、試管等。
無(wú)菌操作設(shè)備：超凈工作臺(tái)、酒精燈、滅菌鍋。
稀釋液：生理鹽水（0.85% NaCl）或磷酸鹽緩沖液（PBS）。
2、滅菌處理：
所有工具和培養(yǎng)基需高壓滅菌（121℃, 20分鐘）。
超凈工作臺(tái)提前開(kāi)啟紫外滅菌30分鐘。
二、樣品處理
樣品預(yù)處理：
固體樣品（如土壤）：取1g樣品加入9mL無(wú)菌稀釋液，振蕩混勻后靜置，取上清液。
液體樣品（如污水）：直接梯度稀釋?zhuān)?0?¹~10??）。
富集培養(yǎng)（可選）：若目標(biāo)菌含量低，可先進(jìn)行選擇性富集培養(yǎng)。
三、分離方法
1、稀釋涂布平板法（最常用）
步驟：
梯度稀釋樣品至10??~10??（不同樣品稀釋度需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。
取0.1mL稀釋液加入固體培養(yǎng)基平板，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布。
倒置培養(yǎng)（細(xì)菌37℃ 24-48h；真菌25-28℃ 3-7天）。
挑取單菌落（形態(tài)、顏色均一）至斜面培養(yǎng)基保存。
2、平板劃線分離法
步驟：
接種環(huán)灼燒冷卻后蘸取樣品，在平板上分區(qū)劃線（4-5區(qū)，后一區(qū)與前區(qū)重疊1-2次）。
通過(guò)逐區(qū)稀釋?zhuān)罱K獲得單菌落。
3、其他方法：
傾注平板法：適用于嚴(yán)格厭氧菌。
選擇培養(yǎng)基法：添加抗生素或特定碳源抑制雜菌。
四、純化與驗(yàn)證
1、純化操作：
將單菌落重復(fù)劃線/涂布2-3次，確保無(wú)雜菌。
觀察菌落形態(tài)、邊緣、顏色、透明度等是否一致。
2、純度驗(yàn)證：
顯微鏡觀察（革蘭染色、芽孢染色等）。
生理生化試驗(yàn)（如氧化酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)）。
分子鑒定（16S rRNA測(cè)序或ITS測(cè)序）。
五、菌種保存
1、短期保存：
斜面培養(yǎng)基4℃保存（細(xì)菌1-3個(gè)月，真菌3-6個(gè)月）。
2、長(zhǎng)期保存：
甘油管冷凍（-80℃）：菌懸液與20%-40%甘油混合。
冷凍干燥法（保存期可達(dá)10年以上）。
六、注意事項(xiàng)
全程嚴(yán)格無(wú)菌操作，酒精燈火焰旁操作。
接種環(huán)需灼燒冷卻后再接觸菌體，避免燙死微生物。
高稀釋度與低稀釋度平板均需保留，防止目標(biāo)菌過(guò)度稀釋。
真菌分離需添加氯霉素（抑制細(xì)菌），細(xì)菌分離可添加放線菌酮（抑制真菌）。
通過(guò)以上步驟，可獲得單一微生物的純培養(yǎng)，為后續(xù)研究（如代謝分析、基因編輯等）奠定基礎(chǔ)。若實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)污染或無(wú)法分離目標(biāo)菌，需檢查操作步驟或優(yōu)化培養(yǎng)基成分。
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