細(xì)胞株構(gòu)建的核心流程與注意事項(xiàng)及常見問題與解決方案！
小楊 / 2025-04-14 09:23:18
百歐博偉生物：細(xì)胞株構(gòu)建是分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中常用的技術(shù)手段，主要用于穩(wěn)定表達(dá)特定基因（如熒光蛋白、功能蛋白或shRNA等）的細(xì)胞系。以下是其核心流程及注意事項(xiàng)：
一、細(xì)胞株構(gòu)建核心流程
1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計
選擇宿主細(xì)胞：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適合的細(xì)胞系（如HEK293、CHO、HeLa等），需考慮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率、增殖速度和代謝特性。
目的基因設(shè)計：構(gòu)建目標(biāo)基因（如過表達(dá)、敲除或突變體），需包含啟動子（如CMV強(qiáng)啟動子）、篩選標(biāo)記（如Puromycin抗性基因、Neomycin抗性基因）及報告基因（如GFP）。
轉(zhuǎn)染方法選擇：根據(jù)細(xì)胞類型選擇脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、病毒載體（慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒）或CRISPR-Cas9系統(tǒng)。
2、載體構(gòu)建
克隆目的基因：將目標(biāo)基因插入表達(dá)載體（如pcDNA3.1、pLVX），通過酶切連接、Gibson組裝或CRISPR定向整合。
驗(yàn)證載體正確性：通過測序、限制性酶切或PCR確認(rèn)載體結(jié)構(gòu)。
3、轉(zhuǎn)染
瞬時轉(zhuǎn)染：快速驗(yàn)證基因表達(dá)（24-72小時），但無法獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：
將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，隨后通過抗生素篩選（如Puromycin、G418）富集成功整合外源基因的細(xì)胞。
病毒轉(zhuǎn)染需先包裝病毒顆粒，再感染靶細(xì)胞。
4、篩選與單克隆化
抗生素篩選：持續(xù)施加選擇性壓力（通常7-14天），淘汰未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
單克隆分離：
有限稀釋法：將細(xì)胞稀釋至0.5-1個/孔接種于96孔板，確保單克隆來源。
流式分選：利用熒光報告基因（如GFP）分選單細(xì)胞。
擴(kuò)大培養(yǎng)：挑選高表達(dá)單克隆擴(kuò)增至6孔板、培養(yǎng)瓶。
5、驗(yàn)證
基因組水平：PCR或qPCR檢測外源基因整合。
轉(zhuǎn)錄水平：RT-qPCR驗(yàn)證mRNA表達(dá)。
蛋白水平：Western blot、免疫熒光或流式細(xì)胞術(shù)檢測目標(biāo)蛋白表達(dá)。
功能驗(yàn)證：根據(jù)基因功能設(shè)計實(shí)驗(yàn)（如酶活性檢測、細(xì)胞表型分析）。
6、擴(kuò)增與保藏
凍存：將驗(yàn)證后的細(xì)胞株分裝凍存于液氮（含10% DMSO的凍存液）。
穩(wěn)定性檢測：連續(xù)傳代（如10代以上）后檢測基因表達(dá)是否穩(wěn)定。
7、表型鑒定（可選）
根據(jù)研究目的進(jìn)行功能分析（如增殖、遷移、凋亡、代謝通路變化等）。
二、常見問題與解決方案
胞株構(gòu)建的核心流程與注意事項(xiàng)及常見問題與解決方案.png)
三、注意事項(xiàng)
嚴(yán)格無菌操作：避免支原體污染（定期檢測）。
單克隆驗(yàn)證：務(wù)必確保單克隆來源，避免混合細(xì)胞干擾結(jié)果。
對照設(shè)置：包括空載體對照、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照及抗生素殺傷曲線實(shí)驗(yàn)。
長期穩(wěn)定性：定期復(fù)蘇凍存細(xì)胞驗(yàn)證表達(dá)一致性。
四、應(yīng)用場景
基因功能研究（過表達(dá)/敲除）
藥物靶點(diǎn)篩選
蛋白生產(chǎn)（如CHO細(xì)胞生產(chǎn)抗體）
疾病模型構(gòu)建（如腫瘤耐藥株）
通過上述流程，可獲得穩(wěn)定、均一的目標(biāo)細(xì)胞株，為后續(xù)研究提供可靠工具。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對購買項(xiàng)目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項(xiàng)目準(zhǔn)確到位，都有相關(guān)人士進(jìn)行維護(hù),確保您在微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因?yàn)榇?，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司與國內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機(jī)構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！