微生物實(shí)驗(yàn)室常見細(xì)胞培養(yǎng)污染判別及應(yīng)對措施有哪些？
小楊 / 2025-03-12 09:59:30
百歐博偉生物：污染是細(xì)胞培養(yǎng)中一個(gè)大敵，一旦污染，前功盡棄。決定要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，首先一定要有強(qiáng)烈的無菌意識(shí)，操作中要遵守嚴(yán)格的操作規(guī)程，不要怕麻煩，越細(xì)心越好。
一般情況下，如果你的細(xì)胞被細(xì)菌污染了，培養(yǎng)皿或瓶中的細(xì)胞狀態(tài)很快就會(huì)發(fā)生變化，表現(xiàn)為胞漿中出現(xiàn)大量的顆粒，液體渾濁、培養(yǎng)基PH下降，變成黃色，貼壁細(xì)胞形態(tài)變圓、會(huì)脫壁死亡；而受到真菌污染的細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)并不會(huì)馬上發(fā)生變化，培養(yǎng)3-4天后，可能才會(huì)在培養(yǎng)皿中看到白色的漂浮物或者黑色的小點(diǎn)兒。
一、常見細(xì)胞培養(yǎng)污染判別
1、真菌污染
真菌種類多，形態(tài)各異，但污染后均不難發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下觀察呈絲狀、管狀或樹枝狀菌絲，縱橫交錯(cuò)穿行于細(xì)胞之間。念珠菌和酵母菌呈卵圓形態(tài)，散在于細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。
2、細(xì)菌污染
污染后大多能改變培養(yǎng)液pH培養(yǎng)液變混濁，毒性大的細(xì)菌很快導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡。加用抗生素的培養(yǎng)用液一般可預(yù)防和排除個(gè)別少量細(xì)菌的污染。細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對細(xì)胞生長影響明顯。
3、支原體污染
支原體(Mycoplasma)是一種沒有細(xì)胞壁的原核生物，大小約0.3-0.8微米。目前，已發(fā)現(xiàn)的支原體品種有100多種。
細(xì)胞培養(yǎng)的支原體污染來源主要有
(1)細(xì)胞之間的交叉污染，這是支原體污染的最主要原因；
(2)細(xì)胞培養(yǎng)操作人員的口腔、皮膚等；
(3)細(xì)胞培養(yǎng)用的組分，如血清、培養(yǎng)液等；
4、黑膠蟲污染
黑膠蟲可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運(yùn)動(dòng)物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。
二、常見細(xì)胞培養(yǎng)污染判別及應(yīng)對措施
細(xì)胞培養(yǎng)中的常見污染主要包括：細(xì)菌、霉菌、支原體、黑膠蟲、病毒和交叉污染等，每一種污染都有各自的特點(diǎn)。如細(xì)菌和霉菌增殖迅速，短時(shí)間就對細(xì)胞造成明顯傷害；而支原體和病毒對細(xì)胞的影響則是一種緩慢長期的過程。下面就具體看看每一種污染。
1、細(xì)菌污染(較容易被發(fā)現(xiàn))
引起原因：操作不規(guī)范或無菌措施不到位等；
（1）細(xì)胞污染后的變化
①污染后由于有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，因此培養(yǎng)基會(huì)短時(shí)間內(nèi)由紅色變?yōu)辄S色；
②由于細(xì)菌大量增殖，培養(yǎng)基變渾濁，稍微振蕩后可見培養(yǎng)基表面有漂浮物；
③普通倒置顯微鏡高倍鏡觀察，胞漿內(nèi)可見大量顆粒(如下圖紅色箭頭)；
④細(xì)胞生長緩慢，逐漸變圓脫落。
如下圖所示：左：懸浮細(xì)胞污染后，可見懸浮細(xì)胞個(gè)體遠(yuǎn)大于桿狀細(xì)菌，而細(xì)菌呈黑色顆粒狀并會(huì)有較快的運(yùn)動(dòng)速度；右：貼壁細(xì)胞，可看到球狀細(xì)菌分布于細(xì)胞周圍并做劇烈運(yùn)動(dòng)。
（2）處理措施
在培養(yǎng)液中添加雙抗(P/S)處理；可用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48h后再換常規(guī)培養(yǎng)液；
另外添加西司他丁鈉和亞胺培南(泰能)處理細(xì)胞，適用于培養(yǎng)用具被打翻、使用了污染的培養(yǎng)液或要培養(yǎng)污染的組織或者凍存細(xì)胞的污染情況。
裸鼠體內(nèi)接種法是比較有效和徹底的除菌方法。主要包括腹水接種和皮下荷瘤分離細(xì)胞。既能徹底清除污染細(xì)菌，又能保持腫瘤細(xì)胞的來源特征和惡性特性。對于一些特別珍貴的腫瘤細(xì)胞，可采用裸鼠體內(nèi)接種法。
2、霉菌污染(較容易被發(fā)現(xiàn))
引起原因：操作不規(guī)范或無菌措施不到位等；
（1）細(xì)胞污染后的變化
①一般來說，培養(yǎng)液不會(huì)變渾濁；
②比較容易發(fā)現(xiàn)，肉眼可見點(diǎn)狀菌落(淡黃色或者白色)漂浮在培養(yǎng)基表面(如下圖左)；
③普通倒置顯微鏡下觀察，可見絮狀交錯(cuò)的菌絲或菌團(tuán)生長在細(xì)胞之間；有時(shí)真菌并不是直接分布于細(xì)胞貼壁層，需要通過調(diào)整顯微鏡仔細(xì)觀察尋找菌絲或菌團(tuán)(如下圖右)。
如下圖所示：懸浮細(xì)胞U397的霉菌污染，黃色圓形發(fā)亮的是U397；紅色箭頭：霉菌的菌絲和孢子囊，特別的是孢子釋放出來后是難以被酒精殺死。
（2）處理措施
添加制霉菌素和兩性霉素B，但是對細(xì)胞的毒性也較大；
環(huán)境徹底消毒：先后用酒精、新潔爾擦洗培養(yǎng)箱；水盤加上飽和量的硫酸銅。
若細(xì)胞不是特別珍貴，建議丟棄。
3、支原體污染(難被發(fā)現(xiàn))
支原體是一種自然界中能獨(dú)立生活的最小微生物，能通過細(xì)菌濾器，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率很高[3]。由于支原體可以與細(xì)胞共存，生長速率受影響較小，而被忽視。支原體污染在細(xì)胞培養(yǎng)污染中最為隱蔽和最難察覺，但是支原體能明顯影響宿主細(xì)胞代謝、RNA合成及基因表達(dá)的作用，因此越來越受到重視。
引起原因：主要來源于是已感染支原體細(xì)胞之間的交叉污染，支原體感染的血清和胰酶等；
（1）細(xì)胞污染后的變化
①培養(yǎng)液不變渾濁，但會(huì)很快變成黃色；
②多數(shù)細(xì)胞在形態(tài)方面少有明顯變化；
③在倒置顯微鏡下可見胞漿出現(xiàn)小顆?；蚩张荩?/div>
（2）處理措施
定期用支原體試劑盒檢測；
換液可以減緩污染情況，但無法根除；
支原體清除試劑盒可以達(dá)到較好效果；
小鼠腹腔巨噬細(xì)胞清除法。
4、黑膠蟲污染
引起原因：往往來源于血清；
（1）細(xì)胞污染后的變化
①低倍鏡下觀察時(shí)可見黑色小點(diǎn)，高倍鏡下可見到其做布朗運(yùn)動(dòng)，像小蟲游來游去；
②細(xì)胞培養(yǎng)液仍然清亮，污染較輕時(shí)對細(xì)胞無影響；若太多就會(huì)對細(xì)胞造成影響。
（2）處理措施
更換血清；增加細(xì)胞密度，提高細(xì)胞的生長率。
5、病毒污染
引起原因：病毒可能來自于血清；
（1）細(xì)胞污染后的變化
①污染后培養(yǎng)液無明顯變化；
②大部分細(xì)胞也不會(huì)有明顯的形態(tài)變化；
6、交叉污染
引起原因：兩種或兩種細(xì)胞以上的實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)器具、試劑等混用而易造成的污染；
檢測手段：可通過鏡檢觀察細(xì)胞形態(tài)是否與所培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)一致來判斷，另外還可以通過各種免疫學(xué)試驗(yàn)、同功酶分析及細(xì)胞遺傳學(xué)方法來確定。
處理方式：針對病毒和交叉污染較難清除，建議丟棄細(xì)胞重新培養(yǎng)；
學(xué)會(huì)對各種污染情況的辨別和處理是一項(xiàng)不可或缺的實(shí)驗(yàn)技能，希望大家在看完我們的文章后結(jié)合你的實(shí)驗(yàn)操作，學(xué)會(huì)如何應(yīng)對細(xì)胞污染。
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