微生物菌種保藏的目的與原理及對(duì)應(yīng)的活化技術(shù)！
小楊 / 2024-06-19 09:06:55
百歐博偉生物：保藏方法不一樣，活化方法就不一樣，都是一一對(duì)應(yīng)的。我們不能強(qiáng)制性的張冠李戴，那樣做出來(lái)試驗(yàn)效果會(huì)有一定折扣。為了這個(gè)折扣，我們有必要探討一下菌種保藏方法和不同保藏方法對(duì)應(yīng)的活化方法。
一、微生物菌種保藏的目的
盡可能的保持菌種的原有性狀和生理活性，不變異、不死亡、不污染、不退化。
菌種保藏最重要的目的就在于如何保持優(yōu)良菌種其優(yōu)良性狀的穩(wěn)定，滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。
二、微生物菌種保藏的原理
1、使微生物的代謝作用降至極低限度，使其處于不活躍的休眠狀態(tài)。通過(guò)降低微生物體內(nèi)的代謝，抑制生長(zhǎng)繁殖，從而延長(zhǎng)菌種的生命，減少變異。
2、從微生物本身來(lái)說(shuō)，就是要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用他們的休眠體，比如說(shuō)芽孢、孢子等。從環(huán)境條件來(lái)說(shuō)，就是要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)適合長(zhǎng)期休眠的環(huán)境條件，比如低溫、干燥、缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)以及添加保護(hù)劑或酸度中和劑等。大多數(shù)菌種的保藏方法都是根據(jù)這些因素或其中部分因素而設(shè)計(jì)的。
3、微生物具有易異變的特性，在保藏過(guò)程必須使微生物代謝處于最不活躍的狀態(tài)但又不死亡，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異或少發(fā)生變異而又保持生命活力。
三、菌種保藏方法和不同保藏方法對(duì)應(yīng)的活化方法
（一）斜面保藏法和活化
1、斜面保藏法操作步驟
斜面保藏法的原理：將斜面保存在4℃條件下，創(chuàng)造低溫環(huán)境，降低菌種活力。再加上斜面接種面積大，開(kāi)口小，也相應(yīng)地減少了污染的機(jī)會(huì)。
(1)制備斜面
斜面制備好后，最好在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天，檢驗(yàn)是否有污染。
(2)斜面接種
平板轉(zhuǎn)接斜面和斜面轉(zhuǎn)接斜面，都是沒(méi)有問(wèn)題，但一定要確保保藏的菌種沒(méi)有污染后，再進(jìn)行轉(zhuǎn)接。
(3)適用對(duì)象
細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等的短期保藏。
一般情況下，近期兩個(gè)月內(nèi)不可能使用、也有可能使用的菌種，都可以采用斜面保藏法保藏。
(4)保藏期
一般保藏期為兩個(gè)月，最好不超過(guò)兩個(gè)月。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，斜面脫水，菌種也會(huì)脫水死亡。
但也要根據(jù)情況進(jìn)行判斷，比如說(shuō)，斜面沒(méi)有什么變化，菌種也沒(méi)有明顯污染，也可以繼續(xù)保藏，但最好轉(zhuǎn)接出來(lái)較為妥當(dāng)。
一般情況，細(xì)菌一個(gè)月，酵母菌、放線菌等兩個(gè)月。
(5)優(yōu)點(diǎn)
操作簡(jiǎn)便，沒(méi)有復(fù)雜的工序，不需要特殊設(shè)備，成本低，容易觀察，隨時(shí)觀察菌種的狀態(tài)，復(fù)蘇方便。
制作斜面一般用玻璃試管，比較透明，可以定期觀察菌種變化，如果發(fā)現(xiàn)污染或斜面脫水等狀況，立即轉(zhuǎn)種。
(6)缺點(diǎn)
保藏期短，菌種容易變異，易污染。
因斜面上只有固體培養(yǎng)基，沒(méi)有特殊的保護(hù)措施，所以培養(yǎng)基本身會(huì)發(fā)生變化，因保藏期短，就需要經(jīng)常傳代，傳代過(guò)程中增加污染的機(jī)會(huì)。
2、斜面保藏菌種活化
斜面保藏法活化菌種比較簡(jiǎn)單，直接用接種環(huán)挑取單菌落，采用“Z”字劃線法在斜面上連續(xù)劃線，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)完成保存至4℃保存。
（二）甘油管保藏法和活化
1、甘油管保藏法操作步驟
甘油管保藏是實(shí)驗(yàn)室常用的菌種保藏方法，它的原理在于，一定濃度的甘油，可以降低水的結(jié)冰溫度，有效地防止細(xì)胞內(nèi)部形成冰晶，甘油還可以與細(xì)胞內(nèi)部分子結(jié)合，從而形成細(xì)胞的保護(hù)層，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。此外，甘油還是一種有機(jī)碳源，可以為細(xì)胞提供一定量的碳源和能源，使其保持活力狀態(tài)。
(1)準(zhǔn)備甘油
甘油比較粘稠，一般采用質(zhì)量比配制即可。
甘油管保藏法中，甘油的終濃度20%-30%即可。
值得注意的是，配好后一定要混勻，甘油密度比較大，會(huì)沉淀到底部，如果不混勻，滅菌效果可能不太好。
(2)甘油管保藏
液體菌種：將培養(yǎng)好的液體菌種和甘油按比例混勻，一般甘油的終濃度20%-30%。
我一般使用50%甘油和菌液1:1混勻，-80℃保藏即可。
平板或斜面菌種：用無(wú)菌水重懸菌種后，與50%甘油1:1混勻，-80℃保藏即可。
通常使用甘油的終濃度在20%~30%，該范圍外的濃度會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，質(zhì)粒會(huì)很容易丟失，甘油濃度太低起不到作用，太高又會(huì)影響菌種活性。
(3)適用對(duì)象
幾乎適用所有菌種保藏，中長(zhǎng)期保藏。
半年到一年內(nèi)可能用到的菌種。
(4)保藏時(shí)間
一般保藏時(shí)間為一年。在實(shí)際操作中，一年以上也沒(méi)問(wèn)題。
(5)優(yōu)點(diǎn)
操作簡(jiǎn)單，保藏期較長(zhǎng)，菌種不容易發(fā)生變異。
(6)缺點(diǎn)
不容易觀察，不易監(jiān)測(cè)菌種變化，不宜反復(fù)凍融。
2、甘油管菌種活化
將甘油管從-80℃取出，融化后，直接用接種環(huán)挑取一環(huán)，采用劃線法在固體培養(yǎng)基上劃線，適宜溫度下倒置培養(yǎng)即可?；蛘哂脽o(wú)菌水適當(dāng)稀釋后涂布至平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)。
小提示：
一種說(shuō)法，甘油管保藏菌種需要“慢凍快化”，即-80℃保藏前，先-20℃預(yù)凍，再放入-80℃保藏；取出使用時(shí)，直接放入37℃快速融化后使用。
另一種說(shuō)法，甘油管保藏菌種需要“慢凍慢化”，即-80℃保藏前，先-20℃預(yù)凍，再放入-80℃保藏；取出使用時(shí)，逐級(jí)融化后使用。
實(shí)際使用時(shí)，甘油管直接-80℃冷凍保藏，使用時(shí)取出來(lái)直接用手捂熱使用，也是符合第一種說(shuō)法的。
效果到底哪種方式好，還需要繼續(xù)研究，等待進(jìn)一步數(shù)據(jù)。
（三）穿刺保藏法和活化
1、穿刺保藏法操作步驟
穿刺保藏法原理是缺氧和低溫，即菌種保存在半固體培養(yǎng)基內(nèi)部，造成缺氧環(huán)境，然后保存于4℃，延長(zhǎng)菌種時(shí)間。
(1)制備半固體培養(yǎng)基
半固體培養(yǎng)基跟固體培養(yǎng)基的區(qū)別在于瓊脂粉含量不同，前者瓊脂粉含量1%，后者含量1.5%-2%。
半固體培養(yǎng)基添加至無(wú)菌試管約1/3處，營(yíng)養(yǎng)不宜太豐富。
值得注意的是，半固體培養(yǎng)基配制好后需要豎起來(lái)，不需要擺斜面。
(2)接種
用接種針挑取少量細(xì)菌，從半固體培養(yǎng)基的中心垂直刺入，直至接近半固體培養(yǎng)基1/2處自上而下穿刺，不要穿透，然后沿原穿刺線將接種針退出，穿入培養(yǎng)基若干次，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待微生物生長(zhǎng)良好后，用2毫米無(wú)菌液體石蠟覆蓋，以創(chuàng)造缺氧環(huán)境并4℃保藏。
(3)保藏時(shí)間
一般3-6月后轉(zhuǎn)種。
有的菌種保存時(shí)間至少可以達(dá)到1 年，有的菌種甚至能達(dá)到20 年之久。
(4)適用對(duì)象
適用于工程大腸桿菌等細(xì)菌，操作簡(jiǎn)便，保存時(shí)間較長(zhǎng)。
(5)優(yōu)點(diǎn)
操作簡(jiǎn)便，保存時(shí)間比斜面保藏法長(zhǎng)。
(6)缺點(diǎn)
比較耗費(fèi)空間，不便于攜帶。
2、穿刺保藏菌種活化
用接種環(huán)沿著菌種方向穿入，挑取菌種，轉(zhuǎn)接至斜面上或平板培養(yǎng)基上，或加入無(wú)菌水搖晃，稀釋涂布即可。
（四）液體石蠟保藏法
液體石蠟保藏法實(shí)際上是斜面保藏法的一種改進(jìn)形式。它的原理基于斜面保藏菌的基礎(chǔ)上，覆蓋一層液體石蠟，創(chuàng)造缺氧環(huán)境而保存于4℃。
1、液體石蠟保藏法
(1)準(zhǔn)備液體石蠟
根據(jù)需要，將液體石蠟進(jìn)行分裝密封，放置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30min，滅菌完成后放置于40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，約4天，或105℃烘箱中1h，待水分蒸發(fā)完全后，備用。
(2)制備斜面菌種
(3)封液體石蠟
將無(wú)菌干燥的液體石蠟注入上述培養(yǎng)好的斜面上，加入石蠟的量以高于斜面頂端1cm為宜，再將試管密封，直立于4℃左右冷藏保存。
覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。要定期添加石蠟保證斜面處于液面以下。
(4)保藏時(shí)間
保藏時(shí)間至少可以達(dá)到1年，甚至更長(zhǎng)。
一般情況，不產(chǎn)芽孢細(xì)菌保藏1年，芽孢菌、放線菌、霉菌可保藏2年，酵母菌可保藏1-2年。
(5)對(duì)象
細(xì)菌，酵母菌，放線菌等。
(6)優(yōu)點(diǎn)
保藏時(shí)間較斜面保藏法長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)便。
(7)缺點(diǎn)
需要直立放置，比較耗費(fèi)空間，不便于攜帶。
2、液體石蠟保藏菌種活化
將保藏的斜面取出來(lái)，用接種環(huán)從液體石蠟下挑取少量菌種，適當(dāng)在試管內(nèi)壁輕點(diǎn)幾下，減少石蠟量，然后采用劃線法接種于新鮮平板上培養(yǎng)，待生長(zhǎng)良好，再次傳代，培養(yǎng)。
3、注意事項(xiàng)
(1)液體石蠟易燃，必須注意火災(zāi)。
(2)移植菌種時(shí)，接種針上帶有石蠟和菌體，火焰滅菌時(shí)易飛賤、爆發(fā)，嚴(yán)防感染。
(3)由于取出的菌種帶有一定量的液體石蠟，生長(zhǎng)較慢且有粘性，因此，需要傳代2次。
（五）沙土管保藏法
沙土管干燥保藏法的原理是在沙土干燥條件下微生物細(xì)胞代謝活動(dòng)減緩，繁殖速度受到抑制，這樣減少菌株突變，延長(zhǎng)菌株存活時(shí)間。將培養(yǎng)好的菌種與無(wú)菌沙土混合，使菌體吸附在沙土載體上，干燥后保存。
1、沙土管保藏法
(1)處理沙土
將沙和土洗凈、烘干、過(guò)40目篩子，將沙與土以2:1的比例混合、分裝（每管1g沙土），滅菌，烘干。
(2)制備孢子懸液
當(dāng)孢子成熟后，用無(wú)菌水洗下制成孢子懸液，備用。
(3)抽干、封口
將孢子懸液加入無(wú)菌的沙土管中，每管0.5mL，通過(guò)減壓干燥的方式去除沙土管中水分，直至水分被抽干，最后用石蠟或橡膠塞封口。
沙土管主要是通過(guò)創(chuàng)造干燥和寡營(yíng)養(yǎng)的條件來(lái)保藏菌種。操作的時(shí)候應(yīng)該注意抽干一步務(wù)必要快，盡量在12h內(nèi)完成，防止孢子萌發(fā)，降低保藏效果。
(4)保藏時(shí)間
兩年左右，根據(jù)菌種特性，保藏時(shí)間可能更長(zhǎng)。
(5)適用對(duì)象
適用于能產(chǎn)生孢子的微生物，如霉菌、放線菌，能形成芽孢的芽孢桿菌也可以采用該方法。
(6)優(yōu)點(diǎn)
保藏效果好，適用性也較廣泛，在抗生素生產(chǎn)工廠應(yīng)用廣泛。
(7)缺點(diǎn)
不能保藏營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。
2、沙土管保藏菌種活化
取出少量沙土顆粒，放入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，或在固體培養(yǎng)基表面涂抹后培養(yǎng)。
3、注意事項(xiàng)
(1)需要選擇適合的沙土材料，排水性好、顆粒細(xì)小均勻、無(wú)害菌和病原菌，并且不含明顯異味。
(2)嚴(yán)格消毒和無(wú)菌操作。
（六）冷凍真空干燥保藏法
冷凍真空干燥保藏法的原理是將菌種冷凍，在減壓下利用升華作用去除水分，使細(xì)胞的生理活動(dòng)趨于停止，從而使菌種長(zhǎng)期維持存活的狀態(tài)。
1、冷凍真空干燥保藏法
(1)制備菌懸液
將處于成熟期的微生物培養(yǎng)物懸浮于無(wú)菌的脫脂奶粉或者海藻糖等保護(hù)劑中制成濃菌液，分裝到無(wú)菌的安瓿瓶中。
(2)抽真空，干燥
將上述安瓿瓶放置于低溫冰箱中冷凍，達(dá)到預(yù)定溫度后對(duì)濃菌液進(jìn)行冷凍干燥處理，之后在真空狀態(tài)下融封安瓿瓶，于20℃保藏。
(3)保藏時(shí)間
五到十年，因保藏期較長(zhǎng)，一定要標(biāo)記清楚，以免遺忘。
(4)適用對(duì)象
適用于大批量菌種的長(zhǎng)期保存。該保藏法是目前適用范圍最廣，保藏效果最好的方法，如果需要長(zhǎng)期保藏就選擇這種方法。
(5)優(yōu)點(diǎn)
適用范圍廣，保藏效果好，存活率高，變異小，便于攜帶。
(6)缺點(diǎn)
因涉及到冷凍抽真空設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室不具備條件，需要到專門(mén)保藏機(jī)構(gòu)保藏，成本增加。
2、冷凍真空干燥保藏菌種活化
(1)安瓿瓶開(kāi)封
先用浸過(guò)75%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，用酒精燈火焰將安瓿管頂端適度加熱，然后用移液器取少量無(wú)菌水，將無(wú)菌水滴至加熱的安瓿管頂端使玻璃開(kāi)裂，最后用挫刀或鑷子敲下已開(kāi)裂的安瓿管的頂端。
(2)復(fù)活方法
先用移液器吸取0.3-0.5mL適宜的液體培養(yǎng)基，滴人安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使菌體溶解呈懸浮狀，然后取0.1-0.2mL菌體懸浮液，移植于適宜的斜面或平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)，適宜的溫度下培養(yǎng)。
（七）液氮超低溫保藏法
液氮超低溫保藏法主要是利用微生物在低于-130°C的低溫下新陳代謝趨于停止的原理，在液氮中（-196°C的超低溫下）有效地進(jìn)行菌種保藏的方法。
1、液氮超低溫保藏法操作步驟
(1)制備菌懸液
離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期微生物細(xì)胞，用新鮮的培養(yǎng)基重懸微生物細(xì)胞。
(2)添加保護(hù)劑
一般使用20%甘油和上述菌懸液等體積混勻，加入無(wú)菌的安瓿瓶中。
(3)冷藏
將上述安瓿瓶緩慢預(yù)冷，最后移至液氮罐中的液相（-196℃）或氣象相（-156℃）作長(zhǎng)期超低溫保藏。
(4)對(duì)象
所有微生物。
(5)保藏時(shí)間
15年以上或更長(zhǎng)。
(6)優(yōu)點(diǎn)
適用性廣，幾乎適用于所有微生物，保藏期長(zhǎng)。
(7)缺點(diǎn)
需要液氮罐等特殊設(shè)備，且管理費(fèi)用高、操作較復(fù)雜、攜帶不便。
四、菌種保藏共同點(diǎn)
1、嚴(yán)格無(wú)菌操作。
2、所保藏的微生物在保藏時(shí)處于良好的狀態(tài)。
3、防止退化的發(fā)生。所以，保藏期一到，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)接重新保種。
總之，菌種保藏是微生物學(xué)的重中之重，根據(jù)微生物的習(xí)性和使用時(shí)間，選擇合適的保藏方法。
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