細(xì)胞復(fù)蘇、傳代與凍存操作流程
一、 儀器與試劑
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儀器 |
試劑 |
耗材 |
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離心機(jī) |
胎牛血清（FBS） |
離心管（15ml、50ml） |
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生物安全柜 |
無(wú)菌1×PBS pH=7.2 |
T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶 |
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電動(dòng)移液器 |
0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA |
一次性無(wú)菌移液管（2ml、5ml、10ml） |
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CO2培養(yǎng)箱 |
完全培養(yǎng)基（含血清） |
1.8mL凍存管 |
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倒置顯微鏡 |
凍存液：90%FBS+10%DMSO |
程序降溫盒 |
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液氮罐 |
異丙醇 |
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恒溫水浴鍋 |
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超低溫冰箱 |
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護(hù)目鏡、厚毛線手套等
二、 操作流程：
復(fù)蘇
1) 將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到37℃；
2) 準(zhǔn)備一支15ml離心管，加入5ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基，放入37℃水浴鍋中預(yù)熱；
3) 戴上護(hù)目鏡，厚毛線手套后，從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡快轉(zhuǎn)入37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動(dòng)凍存管以提高復(fù)溫速率；
4) 將融化了的凍存管中的細(xì)胞吸入事先準(zhǔn)備的離心管中，混勻后，1000rpm離心5min；
5) 準(zhǔn)備一個(gè)T-25培養(yǎng)瓶，寫上細(xì)胞名稱、日期，再加入4ml完全培養(yǎng)基；
6) 離心完成后棄去上清，用1ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入T-25細(xì)胞培養(yǎng)中，混勻后轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)靜置。
注意：從液氮中取出細(xì)胞凍存管時(shí)，若凍存管內(nèi)有液氮進(jìn)入，需擰松凍存管，排出內(nèi)部殘留的液氮，之后擰緊凍存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。
傳代 （細(xì)胞傳代建議一傳二）
1) 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上時(shí)，可進(jìn)行傳代。
2) 在生物安全柜內(nèi)，打開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶口，收集瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基；
3) 向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入3ml無(wú)菌的1×PBS 后，水平放置培養(yǎng)瓶，使PBS能夠浸潤(rùn)到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄PBS；
4) 向瓶?jī)?nèi)加入消化液1ml，浸潤(rùn)底面后放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育1~2min；
5) 孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓飄起，若全部消化下來(lái)則直接向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入2ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基中，將懸液吸入15ml離心管；
注：如還有部分細(xì)胞未消化下來(lái)，可采用分步消化：
① 準(zhǔn)備一個(gè)無(wú)菌的15ml離心管，加入2ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基；
② 將消化下來(lái)的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入1ml胰酶繼續(xù)消化2min左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入2ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。
6) 1000rpm離心5min；
7) 準(zhǔn)備兩個(gè)新的T-25培養(yǎng)瓶，各加入4ml完全培養(yǎng)基。
8) 離心完成后，棄上清，用2ml完全培養(yǎng)基重懸離心細(xì)胞，將重懸后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入2個(gè)T-25培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶各1ml；
9) 水平放置培養(yǎng)瓶，震蕩混勻后，將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
凍存 （細(xì)胞凍存建議每瓶T25凍一支）
1）~5）參照傳代步驟
6）離心完成后，棄上清，用1mL凍存液重懸細(xì)胞沉淀，然后轉(zhuǎn)入1.8ml凍存管中；
7）將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過(guò)夜降溫；
8）第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存