小鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)方法！
小楊 / 2019-11-04 09:19:13
小鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)可以：
（1）用于細(xì)胞保種；
（2）用于分子生物學(xué)研究；
（3）用于基因治療研究。
巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。
實(shí)驗(yàn)材料：小鼠 試劑、試劑盒 .RPMI1640培養(yǎng)基、酚紅、酒精、小牛血清、巰基乙醇酸鈉、雙抗、培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素、臺盼蘭、碘酒。
儀器、耗材：綿球、手術(shù)直剪、注射器、培養(yǎng)皿、超凈臺、解剖板、眼科剪、離心管、眼科鑷。
一、材料準(zhǔn)備
1.動物：各個品系的小鼠2-4只。
2.試劑：RPMI1640培養(yǎng)基(含酚紅)，小牛血清，雙抗，培養(yǎng)液(10%小牛血清、RPMI1640、雙抗)，臺盼蘭等。碘酒綿球和酒精綿球。
3.器械：一次性注射器、手術(shù)器械。
二、操作過程
如果采用刺激物，則可在實(shí)驗(yàn)前三天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉每只2 mL，獲得的巨噬細(xì)胞數(shù)要多一些。不采用刺激物，直接開始下面的步驟。
1.拉頸處死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分鐘，移入超凈臺中，仰臥位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮膚，酒精綿球脫碘。用手術(shù)直剪充分剪開腹部皮膚，暴露腹部肌層，再用酒精綿球消毒腹部肌層。
2.用注射器抽取5 mL含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基注入腹腔，用綿球輕揉腹部1-2 min，然后，用眼科鑷稍提起腹腔，并用眼科剪剪開一個小口，用吸管吸取細(xì)胞懸液，移入離心管中(個人認(rèn)為，此法比用注射器抽吸好一些)。
3.1 000 rpm離心5 min后，用含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌一次，再次離心，重懸細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用，則選擇相應(yīng)的培養(yǎng)液。臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)，將細(xì)胞稀釋到目的濃度后，接種即可。
4.如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用，調(diào)整濃度至2x105個/mL，接種到96孔板中，每孔100-200 μL；如果作為其它實(shí)驗(yàn)使用，可以調(diào)整成2x106/mL，加到24孔平底培養(yǎng)板中，1 mL/孔；5% CO2溫箱孵育2 h后，換液，并用RPMI1640培養(yǎng)基洗1-2次，棄去未粘附細(xì)胞，貼壁細(xì)胞為單層的巨噬細(xì)胞。
三、結(jié)果分析
巨噬細(xì)胞剛貼壁時偏圓形，或者類似鵝卵石形狀，然后慢慢伸出偽足，鋪開呈三角形或多角形。巨噬細(xì)胞有吞噬的特性，當(dāng)與細(xì)菌混合在一起的時候，在40倍物鏡下可以看到巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌，因此，巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞可以清除部分污染的細(xì)菌、支原體和部分細(xì)胞碎片。
四、注意事項
1.巨噬細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不會增殖。
2.很難消化下來，所以接種的時候，必須直接接種到目的培養(yǎng)器皿中。
3.嚴(yán)格無菌操作，在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。
4.為避免交叉感染，每一只小鼠更換注射器。
5.吸管吸取細(xì)胞懸液的時候，盡量不要吸到大小腸，否則容易引起成纖維細(xì)胞污染。
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