BIOBW生物質(zhì)粒菌種 E.coli DH5α λpir
小楊 / 2019-10-23 09:16:16
基本信息
平臺(tái)編號(hào)：bio-82082
規(guī)格：冰袋泡沫盒快遞
拉丁屬名：0
英文名：E.coli DH5α λpir
詳情介紹
貨期：款到1-3天出庫(kù)
運(yùn)輸：冰袋泡沫盒快遞
培養(yǎng)方式：LB,37℃
保存：1ml，甘油管，-80℃
中文名：E.coli DH5α λpir大腸桿菌
抗性：無(wú)
培養(yǎng)基：LB
菌株類(lèi)別：大腸桿菌自殺質(zhì)?？寺【?br />
培養(yǎng)條件：37℃，有氧，LB
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：42℃熱激
保存方式：20%甘油，-20℃
基本應(yīng)用：用于基因克隆
DH5α λpir菌種(DH5α λpir E.coli Strain)操作步驟
（一）獲得目的基因
1、通過(guò)PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2、通過(guò)RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
（二）構(gòu)建重組表達(dá)載體
1、DH5α λpir菌種(DH5α λpir E.coli Strain)載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
（三） 獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
2、 測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。
3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
（四）誘導(dǎo)表達(dá)
1、 DH5α λpir菌種(DH5α λpir E.coli Strain)挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
2、按1∶50比例稀釋過(guò)夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大約需3hr）。
3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻, 70℃10min。
5、離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。
注意事項(xiàng)
1、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。本產(chǎn)品僅可用于實(shí)驗(yàn)室研究，不能用于動(dòng)物，人體以及作為食品添加劑等用途。
2、使用本產(chǎn)品的甘油菌時(shí)可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂布固體瓊脂平板即可，也可以完全融解后使用，但隨著凍融次數(shù)的增加，菌株的活力會(huì)逐漸下降。
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