一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />
通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)。
二、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)菌處于容易吸收外源DNA 的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。其原理是細(xì)菌處于0℃，CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得的新的表型（如Ampr等）得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。
三、實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
⒈超凈工作臺(tái)
⒉低溫離心機(jī)
⒊恒溫?fù)u床
⒋恒溫箱
⒌-70℃
⒍恒溫水浴器
四、實(shí)驗(yàn)材料
⒈氯化鈣(CaCl2)
⒉胰蛋白胨
⒊酵母提取物
⒋氯化鈉(NaCl)
⒌氨芐青霉素
⒍大腸桿菌DH5α
⒎pUC19質(zhì)粒
⒏50ml離心管
⒐吸頭、培養(yǎng)皿、錐形瓶等。
附試劑的配制：
⒈0.1mol/L CaCl2溶液
⒉LB液體培養(yǎng)基
配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入：
胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g
酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g
NaCl 10g
搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,加入去離子水至總體積為1L,121℃濕熱滅菌20min。
⒊氨芐青霉素（Amp）,用無(wú)菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存。
五、實(shí)驗(yàn)步驟
⒈從大腸桿菌DH5α平板上挑取一個(gè)單菌落接于2ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
⒉取0.5 ml菌液轉(zhuǎn)接到一個(gè)含有50ml LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中, 37℃振蕩培養(yǎng)2-3h.(此時(shí),OD600<=0.5,細(xì)胞數(shù)務(wù)必<108/ ml,此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵).
⒊將菌液轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中,冰上放置10min.
⒋離心10min(4000rpm),回收細(xì)胞.
⒌倒出培養(yǎng)液,將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡.
⒍用冰冷的0.1mol/L CaCl210ml懸浮沉淀,立即放在冰上保溫30min。
⒎0-4℃6000rpm，離心10min，回收細(xì)胞。
⒏用冰冷的0.1mol/L CaCl22ml懸浮細(xì)胞 。（務(wù)心放冰上）
⒐分裝細(xì)胞，每200μl一份。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。
⒑取200μl新鮮配制的感受態(tài)細(xì)胞，加入DNA 2μl（50ng）混勻，冰上放置30min。
同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照管：
受體菌對(duì)照：200μl感受態(tài)細(xì)胞+2μl無(wú)菌水
質(zhì)粒對(duì)照：200μl 0.1mol/L CaCl2溶液+2μl質(zhì)粒DNA溶液
⒒將管放到42℃循環(huán)水浴1-2min。
⒓冰浴2min.
⒔每管加800μl LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1h(慢搖)。
⒕將適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，涂在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上。
⒖倒置平皿37℃培養(yǎng)12-16h，出現(xiàn)菌落。
六、作業(yè)
觀(guān)察在含氨芐青霉素的瓊脂糖平板上生長(zhǎng)的菌落生長(zhǎng)情況，并分析原因。
七、實(shí)驗(yàn)安排
15學(xué)時(shí)
第1天下午—第2天上午：配LB培養(yǎng)基，接種，液體培養(yǎng)
第2天上午、下午：繼續(xù)培養(yǎng)2-3h,制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)12-16h
第3天上午：觀(guān)察結(jié)果
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