肝癌細胞系的培養(yǎng)方法
一、材料與方法
⒈材料
DMEM高糖、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司; Anti-Human Thy-1(CD90) FITC、Mouse lgG1 K Isotype Control FITC、Anti-Human EpCAM PE和MouselgG1 K Isotype Control購自eBioscience公司; 五種肝癌細胞系(HepG2、SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403和Sk-Hep-1)均購自中科院上海生命科學(xué)研究院細胞庫,并由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部保存提供; CCK-8試劑購自上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司; 流式細胞儀(美國BD公司)。
⒉肝癌細胞系的培養(yǎng)
肝癌細胞系HepG2用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)。其余四種肝癌細胞系(SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403及Sk-Hep-1)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞在37 °C、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育, 待細胞進入對數(shù)生長期后進行傳代培養(yǎng), 細胞的傳代和收集用0.25%胰蛋白酶消化貼壁生長細胞。PBS洗滌細胞, 然后用 500 μL 2%胎牛血清的PBS重懸細胞, 上機分析。
⒊流式細胞儀檢測分析
取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的肝癌細胞, 0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液, 計數(shù)并調(diào)整細胞數(shù)量約107數(shù)量級; 用含2%胎牛血清的PBS洗滌、離心、重懸細胞為單細胞懸液。分別加入相應(yīng)流式抗體(CD90-FITC, FITC同型對照; EpCAM-PE, PE同型對照)5 μL, 并加入95 μL含2%胎牛血清的PBS至總體積為100 μL, 室溫避光孵育30 min, 并設(shè)立陰性對照。
⒋CCK-8法檢測細胞體外增殖能力
將分選的EpCAM+細胞、EpCAM–細胞和未分選的Bel-7404細胞調(diào)整密度至1×104/mL, 接種至96孔板, 每孔200μL, 置于37 °C、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 隔日換液。在接種后的第1, 3, 5, 7 d隨機取出一塊96孔板, 每孔加入CCK-8試劑20 μL, 細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后在酶標儀上450 nm波長處檢測吸光度(D)值。以生長天數(shù)為橫坐標, 吸光度為縱坐標,繪制三組細胞的生長曲線。
⒌耐藥能力的比較
將分選的EpCAM+細胞、EpCAM–細胞和未分選的Bel-7404細胞調(diào)整密度至1.25×104 /mL, 以200 μL/孔接種至96孔板, 三組細胞都設(shè)置對照組和加藥組。
培養(yǎng)24 h后, 每種細胞加藥組加入12 μmol/L的順鉑。隔天更換相應(yīng)的培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)72 h后, 取出96孔板, 每孔加入20 μL CCK-8試劑, 培養(yǎng)箱中孵育1 h,酶標儀檢測各孔內(nèi)細胞在450 nm處的吸光度(D)值。
計算抑制率: 抑制率(%)=(D0–Dm)/D0 ×100%。Dm和D0 分別為加藥組和對照組的D450值。
⒍平板克隆實驗
將分選的EpCAM + 細胞、EpCAM–細胞和未分選的Bel-7404細胞調(diào)整密度至1×104 /mL, 接種細胞到6孔板, 每孔1000個細胞。6孔板置于37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。15 d后, 棄掉培養(yǎng)液, 進行Gi-emsa染色, 計數(shù) ≥ 50個細胞的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?形成的克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。
⒎統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料的比較用t檢驗, 計數(shù)資料的比較用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
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