神經(jīng)元細胞培養(yǎng)
一、液體配制：
Orthoboric acid 硼砂緩沖液：0.05M四硼化鈉45ml，0.2M Orthoboric acid 55ml，pH8.4；胰酶－EDTA消化液：胰酶－0.125g；EDTA－0.2g；D-Hanks平衡鹽液定容至100ml。所用的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或玻片預先經(jīng)100μg/L多聚賴氨酸 Orthoboric acid鹽緩沖液于37℃包被4h，三蒸水洗三遍晾干備用。
二、操作步驟如下：
1、出生2 d SD大鼠麻醉后，碘酒、75％乙醇**腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預冷的D-Hanks平衡鹽液中。
2、在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱內(nèi)消化20min，中間搖晃一次。
3、隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預冷的培養(yǎng)液（DMEM＋10％FBS）的離心管內(nèi)終止消化液作用5min。
4、用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預冷的DMEM＋10％FBS的離心管內(nèi)，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清吸到另一支離心管內(nèi)。重復上述步驟2～3次。
5、將所收集的上清經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾。
6、過濾后的細胞懸液于800r/min離心5min，棄上清，管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液（DMEM＋20％FBS）并吹打成單細胞懸液。
7、細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度按1.5×105/cm2種入6孔板內(nèi)，放入CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后換液并加入Ara-C使其終濃度為1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量換液。以后每隔3天半量換液一次。
三、無菌操作的注意事項：
細胞原代培養(yǎng)一定要保持工作區(qū)的無菌清潔，先用紫外燈**1h，操作前用75%乙醇**，穿上實驗服，戴上口罩和帽子，操作時不能大聲說話，雙手戴上一次性橡膠手套，整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。
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