微生物的研究
微生物組成的特征
高通量DNA測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)—最初是基于細(xì)菌和古細(xì)菌16S核糖體RNA擴(kuò)增子序列的聚類讀數(shù)，現(xiàn)在是將整個(gè)基因組與生命的所有領(lǐng)域相對(duì)應(yīng)—使樣本直接分類而無(wú)需培養(yǎng)。這些技術(shù)進(jìn)步為剖析來(lái)自不同環(huán)境中的復(fù)雜微生物群落和分析群落結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化提供了一種可靠的方法。雖然個(gè)體間微生物組的組成不同，有時(shí)在個(gè)體內(nèi)部也有明顯的波動(dòng)，但在定植于人體的微生物群落中，其核心特征是存在的1。每個(gè)個(gè)體生存環(huán)境在空間上都是不同的，并且不同程度上由特定的門所支配，不同解剖位點(diǎn)上的特定生境微生物的數(shù)量和分布各不相同2。在腸道中，微生物種類的數(shù)量和多樣性從胃到結(jié)腸呈縱向增加3,4，結(jié)腸是最密集和新陳代謝最活躍的社區(qū)(包括1013個(gè)微生物細(xì)胞)5。對(duì)個(gè)體內(nèi)部和跨個(gè)體微生物多樣性程度的認(rèn)識(shí)正在影響微生物組研究的方式，從對(duì)微生物群落成員的描述性研究轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)微生物群對(duì)健康和疾病的功能作用的機(jī)制研究。
微生物功能的研究
整個(gè)宏基因組學(xué)和元轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作(來(lái)自cDNA文庫(kù))正在定義微生物的功能潛力和實(shí)時(shí)活性，并揭示微生物代謝和宿主發(fā)育之間的相互作用。剖析微生物組的調(diào)控、動(dòng)態(tài)變化以及宿主基因表達(dá)模式的能力揭示了微生物群落的功能是如何影響宿主6，反過(guò)來(lái)，宿主遺傳學(xué)如何塑造微生物組的組成和功能7。而且，宿主和微生物組的宏基因組和元轉(zhuǎn)錄組的同時(shí)測(cè)序也為宿主和微生物群的相互作用機(jī)制以及健康和患病個(gè)體之間的差異提供了深入的見解。此外，隨著鑒定和重構(gòu)基因到更廣泛的生物通路的研究工具的發(fā)展，已經(jīng)能夠把微生物組的功能特征劃分為不同但相關(guān)的類別，這些類別對(duì)host8(BOX 1)的健康至關(guān)重要。
生物化學(xué)活性和結(jié)構(gòu)的分析
質(zhì)譜技術(shù)和色譜技術(shù)已有一個(gè)多世紀(jì)的歷史;然而，它們只是最近才被應(yīng)用于宿主微生物組的研究22–24。靶向和非靶向代謝組學(xué)和代謝蛋白組學(xué)策略都有望揭示合成、設(shè)計(jì)和天然微生物群落的化學(xué)多樣性和充分的生化能力。然而，這些技術(shù)提出了許多與樣品（特別是糞便物質(zhì)）的提取和處理有關(guān)的實(shí)驗(yàn)挑戰(zhàn)25,26。隨著技術(shù)障礙的克服，數(shù)據(jù)分析將繼續(xù)拓寬我們對(duì)微生物組對(duì)宿主生理的廣泛影響的認(rèn)識(shí)，為開發(fā)和測(cè)試診斷和治療方法提供機(jī)會(huì)。
微生物目標(biāo)
鑒于微生物群落的豐富性和多樣性，分析這些群落中的單個(gè)物種和菌株及其相關(guān)功能是很重要的，特別是對(duì)于未能培養(yǎng)或低豐度的微生物27。這可以通過(guò)指定菌株特異性和從整個(gè)宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)組裝單個(gè)基因組的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)28,29，或使用混合捕獲和涉及分離和測(cè)序稀有物種或單個(gè)微生物細(xì)胞(BOX 1)的單細(xì)胞法。這些方法有望能都推動(dòng)改善微流體平臺(tái)和軟件應(yīng)用程序,可以更準(zhǔn)確地捕捉和分析微生物多樣性和增強(qiáng)對(duì)個(gè)體遺傳變異和功能貢獻(xiàn)的理解30。
宿主-微生物相互作用的監(jiān)測(cè)
隨著時(shí)間的推移，新的工具和技術(shù)進(jìn)步極大地促進(jìn)了我們對(duì)復(fù)雜微生物群落及其與宿主的相互作用的理解，涉及到飲食、生活方式的變化以及健康和疾病的狀況。然而，對(duì)于微生物如何在其首選環(huán)境生態(tài)位而不是在培養(yǎng)基中相互作用或與宿主細(xì)胞相互作用的認(rèn)識(shí)有限。最近的兩項(xiàng)研究解決了這一根本挑戰(zhàn)。在第一項(xiàng)研究中31，熒光原位雜交(FISH)結(jié)合單細(xì)胞成像和定量分析軟件，來(lái)測(cè)量腸道微生物的空間組織。飲食攝入對(duì)腸道微生物群和宿主的影響的研究表明，缺乏纖維的飲食會(huì)導(dǎo)致小鼠腸道內(nèi)黏液層減少。失去這個(gè)防護(hù)層導(dǎo)致細(xì)菌與腸上皮細(xì)胞更接近,反過(guò)來(lái),會(huì)觸發(fā)機(jī)體生產(chǎn)抗菌肽(AMP)，再生胰島衍生蛋白3β(REG3β)。微生物可利用的碳水化合物的缺乏極大地改變了不同細(xì)菌群的聚集模式。雖然對(duì)于微生物的空間分布及其影響微生物群落結(jié)構(gòu)的因素還有很多需要了解，但這種成像和分析方法為研究宿主與微生物的相互作用提供了一種新的途徑。第二項(xiàng)研究32利用代謝低聚糖工程(MOE)和生物正交點(diǎn)擊化學(xué)(BCC)結(jié)合全身成像技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行體內(nèi)標(biāo)記和跟蹤。結(jié)合這些技術(shù)，研究人員能夠追蹤一種共生細(xì)菌在腸道內(nèi)的分布、與其他物種競(jìng)爭(zhēng)的能力以及與宿主細(xì)胞的相互作用。這種方法有望實(shí)時(shí)研究宿主-微生物群落的相互作用，獲得微生物生態(tài)位特異性的“直觀的證據(jù)”，以及起源于微生物的代謝產(chǎn)物如何調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)。
代謝產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)
雖然宿主和微生物的代謝可以串聯(lián)發(fā)生，但宿主依靠其微生物組來(lái)擴(kuò)大消化酶和代謝酶的聚集33。腸道微生物群產(chǎn)生了極具多樣的代謝物庫(kù)，從到達(dá)結(jié)腸部的外源未消化飲食成分的發(fā)酵物，到微生物和宿主產(chǎn)生的內(nèi)源性化合物。構(gòu)成宿主與微生物黏膜界面的單層上皮細(xì)胞，使微生物代謝產(chǎn)物能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞并與宿主細(xì)胞相互作用，從而影響免疫反應(yīng)和疾病風(fēng)險(xiǎn)。
短鏈脂肪酸
未消化的復(fù)合碳水化合物是結(jié)腸細(xì)菌發(fā)酵的豐富底物，其主要代謝終端產(chǎn)物為短鏈脂肪酸(SCFAs)，包括乙酸、丁酸和丙酸。腸內(nèi)SCFA濃度(可達(dá)20 - 140mm)34取決于微生物組成、腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間、SCFAs的宿主-微生物代謝通量以及宿主飲食中的纖維含量。這些微生物產(chǎn)生的代謝物不僅是腸道菌群自身的重要能量來(lái)源，也是腸上皮細(xì)胞(IECs)的重要能量來(lái)源。SCFAs除了作為能量產(chǎn)生的局部底物外，還具有多種調(diào)控功能，其對(duì)宿主生理和免疫的影響還有待進(jìn)一步揭示。
AHR配體
腸道微生物群的成員及其特定膳食成分代謝所產(chǎn)生代謝物，可以結(jié)合宿主細(xì)胞上的芳烴受體(AHR)。AHR是一種配體誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，由免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞表達(dá)。AHR最初被認(rèn)為是在異種生物代謝中起作用，但也有證據(jù)表明它在調(diào)節(jié)粘膜免疫反應(yīng)中的作用。小鼠體內(nèi)缺乏AHR或缺乏AHR配體，會(huì)導(dǎo)致腸道微生物組成受到干擾(即富含擬桿菌的細(xì)菌腔負(fù)荷增加)，AMP產(chǎn)量、腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IELs)數(shù)量和IECs轉(zhuǎn)化率下降63。將野生型小鼠的IELs轉(zhuǎn)移至Ahr-/-小鼠，恢復(fù)了IEC屏障功能并使細(xì)菌負(fù)荷正常化63。在野生型小鼠中，缺乏AHR配體增加了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥的嚴(yán)重程度，當(dāng)給小鼠補(bǔ)充含合成AHR配體的飲食時(shí)，該癥狀減弱63。綜上所述，這些研究表明腸道免疫細(xì)胞亞群對(duì)AHR有內(nèi)在的要求，因?yàn)锳HR活性的缺乏會(huì)使宿主容易受到增強(qiáng)的免疫激活和免疫病理的影響，而特定飲食成分的微生物代謝對(duì)于適當(dāng)?shù)腁HR信號(hào)和宿主-微生物共生至關(guān)重要。
AHR的激活受飲食和腸道微生物群組成的影響。只有某些細(xì)菌亞群，尤其是Lactobacilli spp.，才能代謝膳食色氨酸并產(chǎn)生能刺激ILC3s的AHR配體。ILC3s誘導(dǎo)的IL-22的產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)了AMPs的表達(dá)，AMPs通過(guò)隔離金屬離子來(lái)抑制病原菌的適應(yīng)度，從而降低了它們對(duì)病原菌的可用性，如Opportunistic fungus Candida albicans65。因此，內(nèi)源性微生物來(lái)源的色氨酸代謝物可能為宿主提供線索，這些線索對(duì)于抵抗定植和預(yù)防粘膜炎癥至關(guān)重要。最近的證據(jù)表明，AHR具有物種依賴性的配體結(jié)合偏好66，表明宿主常見的配體與其微生物群之間的共同進(jìn)化，作為AHRs的配體，微生物產(chǎn)生的代謝物對(duì)宿主免疫至關(guān)重要，尤其是在粘膜界面的炎癥保護(hù)方面。同時(shí)值得進(jìn)一步研究=其作為感染性和炎性疾病治療的潛力。
微生物的免疫調(diào)節(jié)
先天免疫系統(tǒng)遇到豐富多樣的自身和非自身抗原，并配有種系編碼的模式識(shí)別受體（PRR），以監(jiān)測(cè)，協(xié)調(diào)和響應(yīng)微生物形態(tài)的變化。PRR檢測(cè)細(xì)菌，真菌和病毒來(lái)源的微生物相關(guān)分子模式（MAMP），包括脂多糖，鞭毛蛋白，肽聚糖，甲酰肽和獨(dú)特的核酸結(jié)構(gòu)?？缒ず桶|(zhì)的PRRs啟動(dòng)保守的信號(hào)級(jí)聯(lián)，驅(qū)動(dòng)對(duì)宿主防御至關(guān)重要的刺激或調(diào)節(jié)效應(yīng)反應(yīng)。PRR信號(hào)通路的激活導(dǎo)致AMPs、細(xì)胞因子、趨化因子和凋亡因子的產(chǎn)生，信號(hào)通路的中斷或改變可能有助于疾病發(fā)生。闡明許多微生物產(chǎn)物如何影響PRR介導(dǎo)的反應(yīng)有助于理解宿主和微生物穩(wěn)態(tài)的發(fā)展和維持(圖2)。在這里,我們專注于三個(gè)主要的MAMPs—多糖(PSA),甲酰肽和D-glycero-β-D-manno-heptose-1,7- bisphosphate (HBP)—這有助于理解宿主和微生物的共生和從宿主和微生物相互作用中實(shí)現(xiàn)新的治療機(jī)會(huì)。
甲酰肽和HBP的免疫調(diào)節(jié)。到目前為止，已經(jīng)鑒定了幾種與非經(jīng)典模式識(shí)別受體（PRR）相關(guān)的細(xì)菌因子，包括多糖A（PSA），甲酰肽和D glycero-β-D-manno-heptose-1,7-biphosphate（HBP）。a:來(lái)自Bacteroides fragilis的PSA可以改變脾臟中的CD4+T輔助細(xì)胞1（TH1）-TH2細(xì)胞平衡（未顯示）并且改變外周效應(yīng)T細(xì)胞亞群的平衡。在腸道中，PSA由固有層樹突細(xì)胞（DC）吸收，并加工并呈遞給初始CD4+T細(xì)胞?；罨霓D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGFβ）誘導(dǎo)抗炎forkhead box P3（FOXP3）+調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞的擴(kuò)增和白細(xì)胞介素-10（IL-10）的產(chǎn)生，其抑制炎性TH1和TH17細(xì)胞的活性。b:由所有細(xì)菌釋放的甲酰肽結(jié)合甲酰肽受體（FPR），其是在中性粒細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體。來(lái)自金黃色葡萄球菌的甲酰基肽可通過(guò)FPR1發(fā)出信號(hào)，并有助于傷害感受器驅(qū)動(dòng)的機(jī)械性疼痛的激活和免疫抑制性神經(jīng)肽的釋放。在高納摩爾濃度下，金黃色葡萄球菌衍生的甲酰基肽（稱為酚可溶性調(diào)控蛋白(PSMs)）通過(guò)與FPR2結(jié)合而刺激大量中性粒細(xì)胞流入感染部位。誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞活化導(dǎo)致氧化應(yīng)激的爆發(fā)。PSM通過(guò)在DC中誘導(dǎo)致耐受性表型并抑制TH1細(xì)胞的分化來(lái)影響適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。金黃色葡萄球菌還可以通過(guò)PSM避開吞噬溶酶體，裂解宿主細(xì)胞和分散生物膜，并且還可以殺死競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌（未顯示）。HBP是由革蘭氏陰性細(xì)菌在脂多糖（LPS）生物合成期間產(chǎn)生并在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中檢測(cè)到的單糖。由細(xì)胞外病原體淋病奈瑟氏球菌分泌的HBP通過(guò)TIFA的磷酸化依賴性寡聚化反應(yīng)誘導(dǎo)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。TIFA的激活及其隨后與TNF受體相關(guān)因子6（TRAF6）的相互作用，導(dǎo)致TRAF6泛素依賴性核因子-κB（NF-κB）的激活，從而誘導(dǎo)促炎免疫基因的表達(dá)。IFNγ,干擾素-γ; P,磷酸鹽; TCR，T細(xì)胞受體。
PSA
PSA是八種結(jié)構(gòu)不同的莢膜多糖之一，由Bacteroides fragilis（一種革蘭氏陰性共生體，主要存在于結(jié)腸的外部粘液層中）產(chǎn)生和輸出。這種兩性結(jié)構(gòu)對(duì)B. fragilis 的生長(zhǎng)和有效定植至關(guān)重要，并介導(dǎo)其與其他微生物成員和宿主的相互作用。PSA對(duì)先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞具有多效性調(diào)節(jié)作用。PSA與DC上的Toll樣受體2（TLR2）相互作用82，并通過(guò)CD11c+DCs對(duì)其進(jìn)行取樣，處理和呈遞給T細(xì)胞83,84; 因此，給予PSA可以糾正在無(wú)菌小鼠中觀察到的T輔助1(TH1)細(xì)胞和TH2細(xì)胞之間的不平衡83。在膿腫形成和結(jié)腸炎的臨床前模型中，PSA可以通過(guò)激活CD4+T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)IL-10的產(chǎn)生85，并通過(guò)增強(qiáng)IL-10產(chǎn)生CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的群體頻率和功能來(lái)抑制炎癥86。雖然PSA在脾臟和胃腸道中得到了廣泛的研究，但其抗炎活性卻超出這些區(qū)域。在神經(jīng)炎癥中，PSA對(duì)Treg細(xì)胞的作用需要誘導(dǎo)CD39(也稱為NTPDase 1)表達(dá)，使Treg細(xì)胞遷移到CNS87。CD39是一種重要的調(diào)節(jié)酶，通過(guò)將促炎的胞外ATP轉(zhuǎn)化為低炎癥的ADP來(lái)限制炎癥。CD39表面表達(dá)是區(qū)分人類FOXP3+Treg細(xì)胞與初始T細(xì)胞或其他效應(yīng)T細(xì)胞群的標(biāo)志，而人類FOXP3+ Treg細(xì)胞上調(diào)CD39表達(dá)是其抑制活性的必要條件88。近期對(duì)人外周血單核細(xì)胞的體外研究表明，PSA可增強(qiáng)IL-10產(chǎn)生CD4+ CD39+ FOXP3+Treg細(xì)胞的擴(kuò)增和抑制功能89。Treg細(xì)胞中CD39缺乏與無(wú)法抑制實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎有關(guān)，炎癥性腸病患者中CD39表達(dá)增加與疾病緩解相關(guān)90?？傊R床前模型和體外人體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的機(jī)制研究表明，PSA可能是治療人類自身免疫性疾病的一種有用的免疫調(diào)節(jié)MAMP。
甲酰肽
由甲?；氖荏w(FPRs)識(shí)別的保守的N-甲?；幕虼嬖谟诩?xì)菌中，其密切相關(guān)的基序存在于線粒體中。FPRs還可以檢測(cè)到其他非甲?；瘍?nèi)源性配體，包括血清淀粉樣蛋白A，導(dǎo)管素抗菌肽LL-37和蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A1。FPRs的刺激導(dǎo)致白細(xì)胞的募集和促炎細(xì)胞因子、酶和過(guò)氧化物的產(chǎn)生來(lái)抗感染。FPRs由先天免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)，近期研究表明，F(xiàn)PRs對(duì)非吞噬細(xì)胞的刺激是實(shí)現(xiàn)感染或損傷后組織穩(wěn)態(tài)的必要條件19。鑒于FPRs的不同作用和表達(dá)譜，F(xiàn)PR異常激活在炎癥、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥中的作用已被描述。
致病性金黃色葡萄球菌（Pathogenic S. aureus）產(chǎn)生甲酰肽，稱為酚可溶性調(diào)控蛋白(PSMs)。哪些FPR被PSMs激活取決于PSMs的長(zhǎng)度和二級(jí)結(jié)構(gòu)，而FPR激活的強(qiáng)度取決于PSM的濃度92。在低水平時(shí)，PSMs通過(guò)FPR1呈現(xiàn)弱信號(hào)，但在高水平時(shí)，PSMs是FPR2的強(qiáng)激活劑，誘導(dǎo)顯著的中性粒細(xì)胞流入感染部位并對(duì)宿主細(xì)胞和競(jìng)爭(zhēng)性微生物細(xì)胞造成細(xì)胞毒性損傷93。FPRs還可與痛覺感受器共同作用，介導(dǎo)金黃色葡萄球菌引起的炎癥性疼痛。來(lái)源于金黃色葡萄球菌的甲?；耐ㄟ^(guò)FPR1，有助于激活傷害感受器驅(qū)動(dòng)的機(jī)械性疼痛和免疫抑制性神經(jīng)肽的釋放94。金黃色葡萄球菌還能分泌一些蛋白來(lái)抑制FPRs和阻斷白細(xì)胞遷移95,96。綜上所述，這些研究表明，金黃色葡萄球菌通過(guò)刺激痛覺感受器釋放免疫抑制神經(jīng)肽，間接抑制宿主免疫系統(tǒng)，并通過(guò)FPRs直接抑制，從而允許細(xì)菌在感染組織中傳播。在感染的后期，隨著PSMs的積累，金黃色葡萄球菌可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，進(jìn)一步損傷宿主細(xì)胞和組織。致病性金黃色葡萄球菌的研究突出了宿主對(duì)MAMP識(shí)別的重要性，以及在疾病早期激活先天免疫反應(yīng)的新策略的必要性。鑒于甲?；哪軌蛴行Ъせ钕忍烀庖呦到y(tǒng)，肽脫甲?；敢种苿?如放線菌素)是治療金黃色葡萄球菌等耐藥細(xì)菌有前途的療法97。許多細(xì)菌編碼肽脫甲?；?，這些酶的調(diào)控是細(xì)菌在感染過(guò)程中滅活甲酰基肽并阻斷白細(xì)胞趨化的機(jī)制。甲硫氨酰-tRNA甲酰轉(zhuǎn)移酶（一種引發(fā)參與蛋白質(zhì)合成的甲硫基-tRNA甲酰化反應(yīng)的酶）在金黃色葡萄球菌中基因失活或化學(xué)抑制，從而降低其在體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈感染的能力98。
盡管放線菌素可以驅(qū)動(dòng)在細(xì)菌病原體中甲硫氨酰-tRNA甲酰轉(zhuǎn)移酶的功能缺失突變，并對(duì)肽脫甲酰基酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性，這些突變導(dǎo)致體外和體內(nèi)狀態(tài)的顯著降低99，從而為管理金黃色葡萄球菌感染提供了一種有效的策略。