建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系時(shí)該用哪種抗生素來(lái)篩細(xì)胞呢？
中國(guó)微生物菌種查詢(xún)網(wǎng) / 2019-04-19 09:14:33
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，細(xì)胞轉(zhuǎn)染的步驟基本相同，只是在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞處理會(huì)不一樣。由于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染只能維持幾天，故在轉(zhuǎn)染12～72后就可以在蛋白或基因水平進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)了。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。
通常構(gòu)建的載體上有兩個(gè)抗性基因，如，氨芐青霉素和新霉素。那么建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系時(shí)該用哪種抗生素來(lái)篩細(xì)胞呢？
很多真核表達(dá)質(zhì)粒上都有兩個(gè)抗性基因，但一般其中只有一個(gè)抗性可以用來(lái)篩細(xì)胞。其中氨芐青霉素對(duì)細(xì)胞是沒(méi)有篩選作用的，這是用于構(gòu)建克隆時(shí)篩選細(xì)菌的。所以這種情況下只能用G418。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后用G418來(lái)加壓篩選，其原因是在載體上具有新霉素的抗性基因，當(dāng)載體被轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，由于細(xì)胞擁有了抗新霉素的特性，因此在用新霉素加壓時(shí)，陽(yáng)性細(xì)胞就不會(huì)被G418殺死。相反，未被轉(zhuǎn)染入載體的陰性細(xì)胞由于沒(méi)有對(duì)新霉素的抗性，那么當(dāng)使用G418加壓時(shí)，當(dāng)然就會(huì)被殺死。
如圖，這個(gè)載體就是兩個(gè)抗性，Amp和neo，但兩個(gè)抗性的本質(zhì)區(qū)別在哪？Amp是在bla啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，bla是原核表達(dá)啟動(dòng)子。在大腸桿菌可以表達(dá)，因此，轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒用Amp可以篩選到，而不用G418篩選。而neo是在SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)。SV40是真核表達(dá)啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞表達(dá)。所以只有轉(zhuǎn)入載體的細(xì)胞才能用G418篩選出來(lái)。
當(dāng)然，不是什么抗生素都可以用于細(xì)胞篩選的，得看抗生素作用機(jī)理。氯芐青霉素抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，對(duì)真核生物起不到殺傷作用，因此不能用于細(xì)胞篩選。新霉素是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，作用機(jī)制為作用于細(xì)菌核糖體的30S亞基，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)正常合成，使細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鉀離子、腺嘌呤、核苷酸等重要物質(zhì)外漏，引起菌體死亡，從而達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用，對(duì)真核生物也起不到殺傷作用，因此不能用于細(xì)胞篩選！
G418是一種氨基糖苷類(lèi)似物，在結(jié)構(gòu)上與新霉素、慶大霉素和卡那霉素相似，它通過(guò)干擾核糖體功能來(lái)阻止哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。G418是新霉素的類(lèi)似物，兩者都是通過(guò)抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細(xì)胞的。但是新霉素對(duì)真核細(xì)胞無(wú)作用而G418對(duì)細(xì)菌和真核細(xì)胞都起作用。原因是neo是編碼3‘磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)細(xì)菌APH（氨基糖苷類(lèi)磷酸轉(zhuǎn)移酶）基因?qū)a(chǎn)生分解新霉素和G418的作用。所以這是做穩(wěn)轉(zhuǎn)是為什么用G418篩選了。
G418(氨基糖苷類(lèi)抗生素)為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染試驗(yàn)提供了一種通用方便的選擇。還可以用其他的抗生素嗎？
用于陽(yáng)性細(xì)胞篩選的還可能有潮霉素（標(biāo)有Hyg),等等。根據(jù)載體中所含有的抗性基因進(jìn)行選擇。比如：
1 pBlast 質(zhì)粒 具有氨芐青霉素和Blast抗性，篩細(xì)菌時(shí)用氨芐青霉素，篩細(xì)胞時(shí)用Blast；
2 pZeocin質(zhì)粒 具有卡那霉素和Zeocin抗性，篩細(xì)菌時(shí)用卡那霉素，篩細(xì)胞時(shí)用Zeocin。