大腸桿菌DH5α感受態(tài)制備（CaCl2法）
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-04-19 08:52:10
1.原理
感受態(tài)是指受體細(xì)胞易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。感受態(tài)由受體細(xì)胞的遺傳性狀所決定的，受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。cAMP可提高感受態(tài)水平一萬倍，而Ca2+存在也可大大促進轉(zhuǎn)化的作用。新鮮，幼嫩的細(xì)胞是選擇做感受態(tài)細(xì)胞的佳材料。
帶有外源DNA 的重組質(zhì)粒，在體外構(gòu)建后，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，隨著細(xì)胞的大量復(fù)制、繁殖，才能夠有機會獲得純的重組質(zhì)粒DNA，該過程稱之為轉(zhuǎn)化過程。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化學(xué)試劑）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許外源DNA 的載體分子通過。感受態(tài)細(xì)胞在0℃，CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，而轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羥基--鈣磷酸復(fù)合物，并粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，可促使細(xì)胞迅速收縮，吸收DNA復(fù)合物，完成轉(zhuǎn)化。
大腸桿菌
圖1 大腸桿菌菌落
2.大腸桿菌DH5α感受態(tài)制備實驗步驟：
1）從-80℃冰箱中取出保種的DH5α菌株，用滅菌的槍頭吸取少量保菌液加入至合適的LB液體培養(yǎng)基中，在LB固體培養(yǎng)基進行涂板處理，置于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
2）次日，從LB固體培養(yǎng)基上挑取濕潤，圓滑的大腸桿菌單菌落，接種于無抗生素的5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)過夜，至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100～1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3h至OD600＝3-0.5左右。（注：此步必要時可在顯微鏡下鏡檢菌細(xì)胞是否形態(tài)一致，有無雜菌污染。）
3）在無菌條件下將菌液轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的離心管中，冰上放置10-30min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃，然后4℃，4000rpm/min離心10min；
4）棄掉上清，倒置1 min，以便將培養(yǎng)液流盡；
5）用冰預(yù)冷的1 mol/L的CaCl2溶液10 ml輕輕懸浮細(xì)胞，充分混勻，冰上放置30 min后，4℃下4000rpm/min離心10min；
6）棄掉上清，并倒置1 min，以便最后的培養(yǎng)液流盡；
7）加入4 ml預(yù)冷含15%甘油（已滅菌處理）的0.1 mol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液；
8）感受態(tài)細(xì)胞100 μL分裝，貯存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?br />
3.注意事項：
1）為制備轉(zhuǎn)化效率較高的感受態(tài)細(xì)胞，可將保種液用于制作感受態(tài)細(xì)胞。
2）注意挑取LB固體培養(yǎng)基上濕潤，圓滑的克隆，以防挑取雜菌。
3）進行二次培養(yǎng)的時候，搖床轉(zhuǎn)速應(yīng)選擇較低轉(zhuǎn)速，空載轉(zhuǎn)速在100-150rpm/min左右。
4）制作感受態(tài)的過程中盡量冰上操作，操作的動作盡量輕柔，穩(wěn)??；試驗中所用的試劑，轉(zhuǎn)子，離心機需要提前預(yù)冷。