感覺免疫熒光實驗和涂鴉一樣隨心所欲?實際做起來發(fā)現(xiàn)事情并沒有那么簡單?今天就為大家整理了免疫熒光實驗的常見問題，讓你體驗一把成為細胞“靈魂畫師”的快感!
免疫熒光實驗步驟+經(jīng)驗總結(jié)，做好這些少走彎路!
免疫熒光(Immunofluorescence，IF)，是指利用抗原抗體特異性結(jié)合來顯示目的蛋白的技術(shù)，主要包括直接法和間接法。直接法是蛋白和標(biāo)記熒光素一抗結(jié)合，間接法是蛋白和普通一抗結(jié)合，然后再與帶有熒光基團的二抗結(jié)合。具體實驗流程主要包括固定樣本、通透細胞膜、封閉、孵育一抗/二抗、細胞核復(fù)染、封片等。
免疫熒光實驗一般步驟：
1、固定樣本
目的是為了長久保持細胞的狀態(tài)。通過化學(xué)試劑處理樣本，從而固定細胞結(jié)構(gòu)和蛋白分布。固定劑大體可分為兩大類：交聯(lián)劑和有機溶劑。交聯(lián)劑大多采用的是甲醛、多聚甲醛等醛類物質(zhì)，這一類固定劑通過醛基與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成網(wǎng)絡(luò)，保持蛋白質(zhì)的位置和結(jié)構(gòu)，是最常用的固定劑。在少數(shù)情況下，可能會用到有機溶劑類固定劑，如甲醇、丙酮等。它們是通過變性蛋白質(zhì)的方式對組織進行固定。
為了在固定過程中最大限度地減少固定劑對抗原和細胞結(jié)構(gòu)的破壞，針對不同的細胞器建議采用不同的固定劑。細胞核膜、細胞核仁、中心體、溶酶體、核糖體、自噬體等建議首選有機溶劑來固定。細胞核、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、纖毛、紡錘體、線粒體等建議首選交聯(lián)劑固定。然而固定劑的選擇沒有通用規(guī)則，倘若沒有達到預(yù)期效果，可以更換另一種固定劑。
2、通透細胞膜
通透，就是在細胞膜上打孔，使封閉液和抗體能夠進入細胞。一般情況下，采用醛類固定劑固定的樣本需通透細胞膜，而有機溶劑類固定劑本身就可以通透細胞膜，固定后的細胞不需要再增加通透步驟。通透一般采用表面活性劑Triton-XTM 100。
3、封閉抗體非特異性結(jié)合位點
免疫熒光里，需要封閉掉抗體非特異性結(jié)合位點，封閉液一般采用與二抗同來源的血清。
4、孵育一抗/二抗
用于免疫熒光的一抗，有些偶聯(lián)了熒光基團，可直接檢測熒光信號，更多的一抗沒有偶聯(lián)熒光基團，需要偶聯(lián)熒光基團的二抗與一抗結(jié)合。一抗的特異性和靈敏度是免疫熒光成功與否的關(guān)鍵。
5、細胞核復(fù)染
復(fù)染的染料有多種，復(fù)染可以在二抗孵育后單獨進行，也可以采用含有DAPI的封片劑直接封片。后面的表格中小編給大家總結(jié)了CST可用于細胞核復(fù)染的染料。
6、封片
為了防止熒光淬滅，還需要使用封片劑，CST的ProLong? Gold Antifade Reagent。對熒光淬滅具有很好的抑制效果。使用這種封片液時，蓋好蓋玻片后記得將載玻片放在黑暗處固化24hr，達到最佳的防淬滅效果。
以上，就是熒光免疫實驗的常規(guī)步驟，然而，很有可能，大家在這幾個步驟內(nèi)會出現(xiàn)各種問題，
所以，學(xué)霸姐姐列出了一些常見的實驗問題，供大家參考：
1，我的抗體標(biāo)記后在細胞或組織中看到非特異性背景結(jié)合，可能是什么原因呢?
原因可能很多，包括封閉不足、一抗或二抗?jié)舛冗^高或一抗或二抗降解。通過“無一抗”對照加以確定是否是二抗的問題。否則，我們建議你們嘗試更嚴(yán)格的封閉或更低濃度的一抗或二抗。
2，我的組織里顯示熒光信號到處都是，這是我的二抗嗎?
首先，在所有濾光片下檢查未染色/未標(biāo)記的組織，確定這些信號不是由于內(nèi)源性自發(fā)熒光引起的。這一問題在石蠟切片中尤為明顯。如果對照仍然顯示這是自發(fā)熒光，那么可以在封閉和標(biāo)記前以1mg / mL硼氫化鈉洗滌3×10分鐘進行還原。
3，我在對照細胞的細胞核和線粒體中看到非特異性結(jié)合，但是蛋白質(zhì)結(jié)合不足以將其終止。我應(yīng)該怎么做?
這種二抗非特異性結(jié)合的現(xiàn)象可能是由染料電荷引起的，例如帶負電荷的染料被帶正電荷的細胞組分吸引。為了阻止該現(xiàn)象，使用Image-iT? FX Signal Enhancer(貨號I36933和R37107)能夠抑制結(jié)合物上的染料與細胞組分之間的電荷作用，進而阻斷非特異性結(jié)合。
4，,我使用兩種不同的抗體標(biāo)記我的細胞或組織，但是好像出現(xiàn)了交叉標(biāo)記，每種抗原都出現(xiàn)了相同的染色，為什么會這樣?
我們建議您嘗試?yán)脝紊珜φ沼缅e誤二抗檢測一抗，反之亦然，以檢查是否存在跨物種標(biāo)記。結(jié)果應(yīng)該是陰性的。檢查二抗產(chǎn)品手冊中的交叉吸附種屬說明，以確保該二抗與其他種屬一抗交叉吸附過。另一種可能性是染料的光譜滲濾到其他波長。單色對照(配對正確)可用于檢查此現(xiàn)象。
5，我用二抗標(biāo)記我的細胞或組織，然后封片觀察。但是標(biāo)記好像褪色或是隨時間而變?nèi)趿恕Ｎ以撊绾巫柚惯@一現(xiàn)象?
包括抗體在內(nèi)的一些標(biāo)記親和力較低，它們會在標(biāo)記載玻片的儲存期間隨時間而變?nèi)?。為了減緩這種解離速率，可以在加入二抗后將樣品用甲醛5-15分鐘固定，，用交聯(lián)的方法將二抗固定交聯(lián)。也可以用固化封固劑(如ProLong? Diamond Antifade Mountant)封固樣品，因為固化封固劑可以減緩二抗的擴散。最后，封固劑完全固化之后載玻片應(yīng)低溫保存(最好是-20 )，從而進一步減緩解離。
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Biofavor提供免疫熒光檢測技術(shù)，目前主要可以對石蠟切片、冰凍切片、細胞爬片、組織芯片進行免疫熒光檢測。巴菲爾生物目前已突破傳統(tǒng)的免疫熒光雙標(biāo)限制，開發(fā)出多色免疫熒光技術(shù)(最多可達7色)。
結(jié)果展示：
免疫熒光實驗步驟+經(jīng)驗總結(jié)，做好這些少走彎路!
只需要您提供相應(yīng)的組織標(biāo)本、一抗，巴菲爾生物將提供詳細的試驗流程報告、實驗圖片、實驗數(shù)據(jù)，并返還相應(yīng)的實驗材料(蠟塊、切片等)。
為您大大節(jié)約實驗時間和成本。
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