質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的一個(gè)或多個(gè)能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，其分子量一般在0.2-10KD范圍內(nèi)。由于質(zhì)粒分子小，便于分離和提取，可以攜帶目的基因進(jìn)入細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞或植物體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增與表達(dá)。
質(zhì)粒提取方法即去除 RNA，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對(duì)純凈的質(zhì)粒。質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)技能和基本要求，基因克隆實(shí)驗(yàn)中常將經(jīng)改造后的質(zhì)粒作為運(yùn)送基因的載體，質(zhì)粒提取質(zhì)量的好壞直接影響到酶切、連接、轉(zhuǎn)化等后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因而高效快速地從細(xì)菌細(xì)胞中分離純化質(zhì)粒具有重要意義。
提取質(zhì)粒DNA的方法有很多種，從提取產(chǎn)量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取，從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取，從具體操作方法分可以分為堿裂解法、煮沸法、牙簽法等，各種不同的方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目梢圆捎煤线m的提取方法。實(shí)驗(yàn)室中常用堿裂解法提取質(zhì)粒，該法操作簡便，但若明確其中主要試劑的作用，所提取的質(zhì)粒DNA的純度及質(zhì)量會(huì)更高。
下面簡單介紹一下堿裂法提取質(zhì)粒。
（1）原理
細(xì)菌懸浮液暴露于高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會(huì)使細(xì)胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。盡管堿性溶劑使堿基配對(duì)完全破壞，閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雙鏈仍不會(huì)彼此分離，這因?yàn)樗鼈冊(cè)谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。只要OH-處理的強(qiáng)度和時(shí)間不要太過，當(dāng)pH值恢復(fù)到中性時(shí)，DNA雙鏈就會(huì)再次形成。在裂解過程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用K+取代Na+時(shí)，復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。在SDS存在的條件下，堿水解是一項(xiàng)非常靈活的技術(shù)，它對(duì)E. coli的所有菌株都適用，并且其細(xì)菌培養(yǎng)物的體積可以從1-500mL以上。
（2）主要試劑的作用原理
氫氧化鈉的作用：在堿裂解法中，氫氧化鈉的作用原理是使細(xì)胞膜由脂雙層結(jié)構(gòu)向囊泡化轉(zhuǎn)變，從而使細(xì)胞裂解，氫氧化鈉的作用既能裂解細(xì)胞讓細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來，又是質(zhì)粒DNA和染色體DNA得以分離的關(guān)鍵。但是對(duì)革蘭氏陽性菌來說，提取質(zhì)粒時(shí)不能直接使用堿裂解法，而是先用溶菌酶將肽聚糖層消化，然后才用堿裂解法裂解細(xì)胞。這是因?yàn)楦锾m氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的區(qū)別及特點(diǎn)不同。
十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)的作用：SDS其實(shí)也是一種細(xì)胞裂解劑，其裂解細(xì)胞的能力比氫氧化鈉要弱很多。此處使用SDS是因?yàn)镾DS通常用作蛋白質(zhì)的變性劑和助溶劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。幾乎所有的蛋白質(zhì)能溶解在SDS中，甚至包括疏水和變性的蛋白。DNA提取過程中，SDS使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開。
5mol/L的醋酸鉀溶液的作用：醋酸鉀溶液不但可以中和之前溶液Ⅱ中的氫氧化鈉，還使得溶液的酸堿度劇烈下降，避免染色體DNA長時(shí)間暴露于強(qiáng)堿環(huán)境而斷裂(斷裂后就不好去除)，又使得質(zhì)?？梢詮?fù)性。此外，SDS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(potassium dodecylsulfate，PDS)，而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。
沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。由于平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀。染色體DNA容易被PDS給共沉淀了。又由于高鹽條件也會(huì)導(dǎo)致SDS形成沉淀，而5mol/L的醋酸鉀本身就是高鹽溶液。利用高鹽環(huán)境促進(jìn)沉淀的原理，有時(shí)也可以利用l0mol/L醋酸銨來代替。
質(zhì)粒提取
質(zhì)粒提取示意圖
（3）優(yōu)點(diǎn)
堿裂解法在提取質(zhì)粒時(shí)具有一箭雙雕的作用：一方面是將細(xì)胞裂解，另一方面是形成高堿性的環(huán)境，使染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性，為下一步質(zhì)粒DNA的復(fù)性及與染色體DNA分離做準(zhǔn)備。
（4）鑒定
質(zhì)粒提取以后，采用瓊脂糖電泳進(jìn)行質(zhì)粒DNA鑒定時(shí)，多數(shù)情況下能看到三條帶，但不是平?？吹降某菪?、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，可以采用EcoRI來線性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會(huì)看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。
其實(shí)這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果不小心在溶液（即NaOH和SDS）加入后過度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時(shí)候抽提到的質(zhì)粒會(huì)有7-10條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致，這里暫不深究。