一種新型細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)方法的簡(jiǎn)要介紹
中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-04-03 09:19:23
一.傳統(tǒng)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)技術(shù)—?jiǎng)澓蹖?shí)驗(yàn)
1.基本原理
細(xì)胞劃痕（修復(fù)）法是簡(jiǎn)捷測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的方法，類似體外傷口愈合模型，在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上， 用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間（例如72h），取出細(xì)胞培養(yǎng)板，觀察周邊細(xì)胞是否生長(zhǎng)（修復(fù)）至中央劃痕區(qū)，以此判斷細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移能力，實(shí)驗(yàn)通常需設(shè)定正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別，通過不同分組之間的細(xì)胞對(duì)于劃痕區(qū)的修復(fù)能力，可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力。
實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞樣品
試劑、試劑盒 無血清培養(yǎng)基 PBS
儀器、耗材 6孔板 maker筆 直尺 槍頭
實(shí)驗(yàn)步驟
準(zhǔn)備：
所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和marker筆等在操作前，需紫外照射30min（超凈臺(tái)內(nèi)）
流程
1.先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃?rùn)M線，大約每隔0.5-1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。
2.在空中加入約5X105個(gè)細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。
3.第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。
4.用PBS洗細(xì)胞3次，去處劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。
5.放入37度5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，6，12，24小時(shí)取樣，拍照。
2、操作步驟
（1）先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃?rùn)M線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。
（2）在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞種類不同而不同，接種原則為過夜后融合率達(dá)到100%。
（3）第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜(不同孔之間最好使用同一只槍頭)。
（4）PBS洗細(xì)胞3次，去處劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。
（5）放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。可按0，6，12，24h時(shí)間點(diǎn)取樣，拍照(具體時(shí)間依實(shí)驗(yàn)需要而定)。
（6）統(tǒng)計(jì)方法：使用Image J軟件打開圖片后，隨機(jī)劃取6至8條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。
3.注意事項(xiàng)：
（1）在用PBS緩沖液沖洗時(shí)，貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)拍照結(jié)果。
（2）一般做劃痕實(shí)驗(yàn)，都是無血清或者低血清（<2%）否則細(xì)胞增殖就不能忽略。
（3）按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測(cè)點(diǎn)，以解決了前后觀察時(shí)位置不固定的問題。
二．傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法主要問題
傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法缺點(diǎn)是細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，即使在無血清或低血清條件時(shí)，細(xì)胞的狀
態(tài)、代謝等方面會(huì)受到影響，由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)，細(xì)胞遷移的速度也會(huì)
慢很多；另外創(chuàng)建“傷口”也可能時(shí)大時(shí)小，邊緣不整齊等誤差；還有在鏡下拍照觀察時(shí)，
每次觀察點(diǎn)基本不可能做到完全一致等。
三．最新實(shí)驗(yàn)解決方法-------傷口愈合劃痕插件
可黏附底部；生物相容硅膠材料；9 mm x 9 mm x 5 mm；兩孔（70μl/孔）；每孔生長(zhǎng)面積0.22 cm2；可產(chǎn)生500 μm寬的“gap”
特點(diǎn)：
1. 在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過程。
2. 非常適合研究細(xì)胞與胞外基質(zhì)（ECM），細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用引起的細(xì)胞遷移。
3. 與包括活細(xì)胞成像在內(nèi)的顯微鏡系統(tǒng)兼容，可用于分析細(xì)胞間的相互作用。
4. 研究細(xì)胞遷移的體外實(shí)驗(yàn)中最簡(jiǎn)單的方法。
細(xì)胞培養(yǎng)插件方法與傳統(tǒng)劃痕實(shí)驗(yàn)比較
細(xì)胞培養(yǎng)插件提供重復(fù)性更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
四.方案小結(jié)
（1） 新型細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)方法可以保證劃痕的標(biāo)準(zhǔn)化，保證了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性－對(duì)比槍頭劃痕，劃痕會(huì)歪歪扭扭，無法保證每次都一樣；
（2）新型細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)方法可以避免槍頭劃痕會(huì)傷到包被；手動(dòng)劃痕傷到包被的話，會(huì)直接影響了細(xì)胞遷移的結(jié)果；
（3）直接鏡檢觀察，成像效果良好；
（4）新型細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)方法有配套的圖像分析，圖像分析是通過計(jì)算實(shí)驗(yàn)區(qū)域的空白面積來計(jì)算愈合情況的，比分析計(jì)算的要更客觀準(zhǔn)確；
（5）產(chǎn)品用法簡(jiǎn)介： 只需要在插件的兩個(gè)孔里種細(xì)胞，等細(xì)胞貼壁了再拔掉這個(gè)插件，細(xì)胞之間就會(huì)留下一道標(biāo)準(zhǔn)的劃痕，就可以開始定時(shí)觀察細(xì)胞愈合的情況了；
（6）多種規(guī)格適合不同的實(shí)驗(yàn)流程，2孔，3孔，4孔，帶培養(yǎng)皿或者插件，細(xì)胞追蹤實(shí)驗(yàn)專用插件培養(yǎng)皿等