1 材料與方法
1. 1 實(shí)驗(yàn)材料
1. 1. 1 菌種
ATCC菌種 S tap hylococcus ep ider mids ( 表皮葡萄球菌)AT CC26069; Stap hylococcus x ylosus ( 木糖葡 萄球菌)ATCC29971; S tap hylococcus albus( 白色葡萄球菌)1. 184; S tap hylococcus inter medius( 中間葡萄球菌)1109;Escherichia coli( 大腸桿菌)AT CC25922; E . coli( 大腸桿菌)AT CC35401; Salmonella typ himurium( 傷寒桿
菌)AT CC14028; Salmonella ty phimurium ( 傷 寒桿 菌)50071; Shigella dy senteriae ( 痢疾 志賀 氏菌)1. 1869; Strep tococcus hemolytis( 甲型溶血性鏈球菌)32205; Strep tococcus hemoly tis( 乙型溶血性鏈球菌)32204; L isteria monocy togenes( 單核增生李斯特氏菌)ATCC35152; L isteria monocytogenes( 單核增生李斯特氏菌)AT CC35152; Bacillus cereus( 蠟樣芽孢桿菌)AT CC11778; Yersinia enterocolitica ( 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌)52001; Vibrio p ar ahaemolyticus ( 副溶血性弧菌)20001; K lebsiella p neumoniae( 肺炎克雷伯氏菌)ATCC46114; K lebsiella p neumoniae( 肺炎克雷伯氏菌)AT CC46117.菌種接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中, 36 , 振蕩過(guò)夜培養(yǎng)至菌懸液濃度達(dá)到 109CFU/ mL.
1. 1. 2 培養(yǎng)基
營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,
1. 1. 3 乳粉
乳粉均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?
1. 1. 4 化學(xué)試劑
10 倍 PCR buffer, dNT Ps, T aKaRa Taq, DNA M arker DL2000 購(gòu)自大連寶生物工程公司; 引物( 正向引物, 反向引物)
1. 1. 5 實(shí)驗(yàn)儀器
PCR 儀為 Whatman T Gradient 基因擴(kuò)增儀, 電泳儀為北京市六一廠生產(chǎn)的DXY33A 型電泳儀, UVIpro 凝膠成像系統(tǒng).
1. 2 方 法
1. 2. 1 乳粉人工污染
在人工污染肺炎克雷伯氏菌前, 該乳粉按標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)證實(shí)不含有肺炎克雷伯氏菌. 將肺炎克雷伯氏菌人工污染到乳粉中, 使樣品中肺炎克雷伯氏菌達(dá)到 10- 1~ 107CFU/ mL, 直接提取人工污染的乳粉中的肺炎克雷伯氏菌 DNA.
1. 2. 2 DNA 提取
將乳粉與滅菌水混合, 質(zhì)量濃度為 10 g / mL, 取 10 mL 還原乳以 500 r/ min 離心 10 min. 吸取上清液加入另一滅菌離心管中以 14 000 r/ min 離心 10 min, 沉淀物用 500 L 生理鹽水懸浮, 加入 0. 25 倍體積的乙酸乙酯, 振蕩器混勻 2 min, 然后以 17 000 r/ min 離心 10 min. 去掉上清液, 沉淀物用 20 L 生理鹽水懸浮, 加入直徑 2. 00 mm 濾膜片, 56 干燥, 干燥后的濾膜片加入 0. 1 g/ mL SDS 溶液 200L 煮沸10 min, 用濾膜專用緩沖液洗滌 2 次, 然后再用 TE 緩沖液洗滌 2 次, 56 干燥后即可作為 PCR 反應(yīng)的模板.
1. 2. 3 PCR 法檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌
1. 2. 3. 1 PCR 引物 引物序列通過(guò) Oligo6. 0 設(shè)計(jì)并在 NCBI 上進(jìn)行 BLAST, 篩選出特異性的引物
1) , 由大連寶生物公司合成. 從金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、單核增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯氏菌中提取 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增, 檢測(cè)引物特異性
1. 2. 3. 2 PCR 反應(yīng)體系 總反應(yīng)體系 50 L, 包括 5 L 10 倍 PCRbuffer, 4 L dNTPs 混合物, 0. 5 L40 mol正向引物, 0. 5L 40 mol反向引物, 0. 25 L( 5 U / L) T aq, 模板 2 L, 水 37. 75 L.
1. 2. 3. 3 PCR 擴(kuò)增程序條件的優(yōu)化 PCR 反應(yīng)采用冷啟動(dòng). 94 預(yù)變性 5 min; 94 變性 45 s、退火( 56 5) 60 s、延伸 72 45 s, 35 個(gè)循環(huán); 最后 72 延伸 5 min, 4 保存.
1. 2. 3. 4 電泳檢測(cè) 取 1 L 的 6 倍 Loading Buffer 和 5L PCR 產(chǎn)物混合后, 置于 20 g/ L 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳, 利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像.
1. 2. 3. 5 PCR 產(chǎn)物鑒定 大連寶生物工程公司對(duì) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 DNA 測(cè)序.
2 結(jié)果與分析
2. 1 PCR 引物特異性的檢測(cè)
本研究通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件結(jié)合肺炎克雷伯氏菌的 IT S 特異性基因序列進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì), 并通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物信息中心的在線 BLAST 進(jìn)行比對(duì), 篩選出特異性的引物對(duì), 同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、單核增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯氏菌中提取 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增, 電泳檢測(cè)結(jié)果證實(shí)設(shè)計(jì)的引物特異性可以滿足檢測(cè)要求
2. 2 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化
為了保證乳粉中肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)的高效, 對(duì) PCR 反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化, 最終篩選出 59. 2 為最佳退火溫度 .
2. 3 PCR 檢測(cè)結(jié)果
本研究通過(guò)FTA 濾膜法直接從含有10 CFU/ mL 肺炎克雷伯氏菌的人工污染乳粉中提取了肺炎克雷伯氏菌的 DNA. 利用 PCR 擴(kuò)增技術(shù), 成功地檢測(cè)出了人工污染的乳粉中的肺炎克雷伯氏菌. 可知乳粉的檢出限是 10 CFU/ mL, 檢測(cè)結(jié)果
2. 4 PCR 產(chǎn)物鑒定
為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性, 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了純化, 交由大連寶生物工程公司對(duì) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA 測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果見表 2, 可知 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 DNA 序列與文獻(xiàn)報(bào)道的靶基因序列的同源性達(dá)100 % , 從而證實(shí) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為目的擴(kuò)增產(chǎn)物
3 討 論
早期的研究人員利用 PCR 從脫脂乳中檢測(cè)出 105CFU / mL 的肺炎克雷伯氏菌, 該檢測(cè)的靈敏度( 105CFU / mL) 較低, 可能是提取的 DNA 中含有 PCR 反應(yīng)抑制因子或是 PCR 反應(yīng)條件沒有最優(yōu)化所致. Brakstad 等[ 7] 利用 PCR 擴(kuò)增肺炎克雷伯氏菌的 nuc 基因來(lái)檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的肺炎克雷伯氏菌, 靈敏度達(dá)到 10 CFU/ mL, 但從血樣品中提取肺炎克雷伯氏菌的 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增時(shí), 其靈敏度降為 103CFU / mL. 這可能是從血樣品提取的 DNA 中含有 PCR 反應(yīng)抑制因子所致.食品的成分極為復(fù)雜, 有些成分為 PCR 反應(yīng)抑制因子, 可導(dǎo)致 PCR 檢測(cè)靈敏度的下降. 食品中的脂肪成分被認(rèn)為是降低 PCR 檢測(cè)靈敏度的主要因素之一[ 8]. M clauchlin 等[ 9] 報(bào)道從奶酪中提取的 DNA 中含有PCR 反應(yīng)抑制因子, 影響 PCR 檢測(cè). Lantz 等[ 10] 利用多重 PCR 技術(shù)檢測(cè)豬肉樣品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌, 該方法對(duì)樣品進(jìn)行增菌后, 使檢測(cè)靈敏度達(dá)到 102CFU/ mL. Jinneman 等[ 11] 利用多重PCR 擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)原料奶、牛肉等樣品中 E . coli O157H7 的 DNA, 也是利用增菌來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度. 雖然增菌提高了檢測(cè)靈敏度, 但也延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間, 一般可延長(zhǎng) 12~ 24 h. 本研究無(wú)需增菌, 直接從污染肺炎克雷伯氏菌的乳品中提取 DNA, 利用 PCR 技術(shù)對(duì)肺炎克雷伯氏菌的 ITS 基因進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)該菌. 該方法可直接從人工污染的乳粉中檢測(cè)出肺炎克雷伯氏菌, 最低檢出限為 10 CFU/ mL, 整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在 6 h 內(nèi)完成, 比目前普遍采用的先增菌再進(jìn)行 PCR 檢測(cè)的方法縮短了 12~ 24 h, 其檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于導(dǎo)致食物中毒所需的肺炎克雷伯氏菌數(shù)[ 12]. 該方法能快速、有效地檢測(cè)乳及乳制品中肺炎克雷伯氏菌, 而且還可以用來(lái)監(jiān)測(cè) HACCP 的危害,
分析關(guān)鍵控制點(diǎn), 以監(jiān)控在牛奶的收集過(guò)程以及產(chǎn)品加工后肺炎克雷伯氏菌的污染情況！