百歐博偉生物食品中病原性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn)！-ATCC菌種
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2018-11-26 09:02:01
大腸埃希菌是人體不可缺少單細(xì)胞生物。大腸埃希菌，俗名大腸桿菌（ 革蘭氏陰性短桿菌），周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無芽。是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌。大腸埃希菌的致病物質(zhì)之一是血漿凝固酶。根據(jù)致病性的不同，致瀉性大腸埃希菌被分為產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌、腸道侵襲性大腸埃希菌、腸道致病性大腸埃希菌、腸集聚性黏附性大腸埃希菌和腸出血性大腸埃希菌5種。 ATCC菌種
一、目的
1、了解病原性大腸艾希氏菌的種類于非病原性大腸艾希氏菌的區(qū)別。
2、掌握病原性大腸艾希氏菌檢驗(yàn)的原理和方法。
二、原理
正常情況下，大腸艾希氏菌不致病，而且還能合成維生素B和K，生產(chǎn)大腸菌素，對機(jī)體有利。但當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或大腸艾希氏菌侵入腸外組織或器官時(shí)，可作為條件性致病菌而引起腸道外感染。有些血清型可引起腸道感染，已知的引起致病性大腸艾希氏菌有四類，即產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌、出血性大腸艾希氏菌、腸道侵襲性大腸艾希氏菌和腸道致病性大腸艾希氏菌，后者主要引起新生兒的腹瀉。帶菌的牛和豬是傳播本菌引起食物中毒的重要原因，人的帶菌亦可污染食品，引起中毒。
三、材料
1、菌種和食品檢樣
產(chǎn)不耐熱腸毒素（LT）和產(chǎn)耐熱腸毒素（ST）大腸艾希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、食品檢樣。
2、試劑和培養(yǎng)基
多粘菌素B紙片；0.1％硫椰汞溶液；2％伊文思藍(lán)溶液；革蘭氏染色液。
乳糖膽鹽發(fā)酵管；營養(yǎng)肉湯；腸道菌增菌肉湯；麥康凱瓊脂；伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)；三糖鐵瓊脂(TSI)；克氏雙糖鐵瓊脂(KI)；糖發(fā)形管(乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇)；賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基；尿素瓊脂(pH7．2)；氰化鉀培養(yǎng)基；蛋白陳水、靛基質(zhì)試劑；半固體瓊脂；Honda氏產(chǎn)毒肉湯；E1ek氏培養(yǎng)基；氧化酶試劑。
3、動(dòng)物和血清
小白鼠：1日齡一4日齡；致病性大腸艾希氏菌診斷血清；侵襲性大腸艾希氏菌診斷血清；產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌診斷血清；出血性大腸艾希氏菌診斷血清；產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌LT和ST酶標(biāo)診斷試劑盒；抗LT抗毒素。
4、設(shè)備與材料
天平；均質(zhì)器或乳缽；溫箱(36土1)℃、42℃；水浴：顯微鏡；離心機(jī)；酶標(biāo)儀；細(xì)菌濃度比濁管；滅菌廣口瓶；滅菌三角燒瓶；滅菌平皿；滅菌試管；滅菌吸管；橡膠乳頭；載玻片；酒精燈；滅菌金屬匙或玻璃棒；接種棒、鎳鉻絲；)接種棒、鎳鉻絲；試管架、試管簍；冰箱；注射器；滅菌的刀子、剪子、鑷子；硝酸纖維素濾膜。
四、操作方法
1、增菌
樣品采集后應(yīng)盡快檢驗(yàn)。以無菌操作稱取檢樣25g，加在225mL營養(yǎng)肉湯中，以均質(zhì)器打碎1min或用乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種乳糖膽鹽培養(yǎng)基，以測定大腸菌群MPN，其余的移入500mL廣口瓶內(nèi)，于36土1℃培養(yǎng)6h。挑取1環(huán)，接種于1管30mL腸道菌增菌肉場內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18h。
2、分離
將乳糖發(fā)酵陽性的乳糖膽鹽發(fā)酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)瓊脂平板；污染嚴(yán)重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)平板，于36土1℃培養(yǎng)18h一24h，觀察菌落。不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時(shí)也要注意乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。
3、生化試驗(yàn)
①自鑒別平板上直接挑取數(shù)個(gè)菌落分別接種三糖鐵(TSl)或克氏雙糖鐵瓊脂(KI)。同時(shí)將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、半固體、pH7.2尿素、瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)物均在36℃培養(yǎng)過夜。
②TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，H2S陰性，KCN陰性和尿素陰性的培養(yǎng)物為大腸艾希氏菌。TSI底層不產(chǎn)酸，或H2S、KCN、尿素有任一項(xiàng)為陽性的培養(yǎng)物，均非大腸艾希氏菌。必要時(shí)做氧化酶試驗(yàn)或革蘭氏染色鏡檢。
4、血清學(xué)試驗(yàn)
①假定試驗(yàn)
挑取經(jīng)生化試驗(yàn)證實(shí)為大腸艾希氏菌的瓊脂培養(yǎng)物，用致病性大腸艾希氏菌、侵襲性大腸艾希氏苗、產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌多價(jià)O血清和出血性大腸艾希氏苗O157，血清做玻片凝集試驗(yàn)。當(dāng)與某一種多價(jià)O血清凝集時(shí)，再與該多價(jià)血清所包含的單價(jià)O血清做試驗(yàn)。致病性大腸艾希氏菌所包括的O抗原群見表9—1。如與某一個(gè)單價(jià)O血清呈現(xiàn)強(qiáng)凝集反應(yīng)，即為假定試驗(yàn)陽性。
②證實(shí)實(shí)驗(yàn)
制備O抗原懸液，稀釋至與MacFarland 3號(hào)比濁管相當(dāng)?shù)臐舛?。原效價(jià)為1:160—1:320的O血清，用0.％鹽水稀釋至1:40。稀釋血清與抗原懸液在10mm×75mm試管內(nèi)等量混合，做試管凝集試驗(yàn)?；靹蚝蠓庞?0℃水浴箱內(nèi)，經(jīng)16h后觀察結(jié)果。如出現(xiàn)凝集，可證實(shí)為該O抗原。
5、腸毒素試驗(yàn)
(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測LT和ST
①產(chǎn)毒培養(yǎng)
將試驗(yàn)菌株和陽性及陰性對照菌株分別接種于0.6mLCAYE培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。加入20000IU／ml的多粘菌素B0.05mL，于37℃培養(yǎng)1h，4000r／min離心15min，分離上清液，加入0.1％硫柳汞0.05ml，于4℃保存待用。
②LT檢測方法(雙抗體夾心法)
包被：先在產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌CT和ST酶標(biāo)診斷試劑盒中取出包被用LT抗體管，加入包被液0.5ml，混勻后全部吸出于3.6ml包被液中混勻，以每孔100μl量加入到40孔聚苯乙烯硬反應(yīng)板中，第一孔留空作對照，于4℃冰箱濕盒中過夜。
洗板：將板中溶液甩去，用洗滌液I洗3次，甩盡液體，翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板，在吸水紙上拍打，去盡孔中殘留液體。
封閉：每孔加100μL封閉液，于37℃水浴中l(wèi)h。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
加樣本：每孔分別加多種試驗(yàn)菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)液100μl，37℃水浴中l(wèi)h。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
加酶標(biāo)抗體：先在酶標(biāo)LT抗體管中加0.5ml稀釋液，混勻后全部吸出于3.6ml稀釋液中混勻，每孔加100μl，37℃水浴中1h。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
酶底物反應(yīng)：每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100μl，室溫下避光作用5min~10min，加入終液50μl。
結(jié)果判定：以酶標(biāo)儀在波長492nm下測定吸光度0D值，待測標(biāo)本OD值大于陰性對照3倍以上為陽性，目測顏色為桶黃色或明顯高于陰性對照為陽性。
③ST檢測方法(抗原競爭法)
包被：先在包被用ST抗原管中加0.5ml包被液，混勻后全部吸出于1. 6ml包被液中混勻，以每孔50μl加入于40孔聚苯乙烯軟反應(yīng)板中。加液后輕輕敲板，使液體布滿孔底。第一孔留空作對照，置4℃冰箱濕盒中過夜。
洗板：用洗滌液I洗3次，操作同上。
封閉：每孔加100μl封閉液，37℃水浴比。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
加樣本及ST單克隆抗體：每孔分別加各試驗(yàn)菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)液50μl、稀釋的ST單克隆抗體50μl (先在ST單克隆抗體管中加0.5mL稀釋液，混勻后全部吸出于1.6ml稀釋液中，混合)，37℃水浴1h。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
加酶標(biāo)記兔抗鼠1g復(fù)合物：先在酶標(biāo)記免抗鼠1g復(fù)合物管中加0.5mL稀釋液，混勻后全部吸出于3.6mL稀釋液中混勻，每孔加100μl，37℃水浴1h。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
酶底板反應(yīng)：每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100μl，室溫下避光5min~10min，再加入終止液50μl。
結(jié)果判定：以酶標(biāo)儀在波長492nm下測定吸光度OD值；目測無色或明顯淡于陰性對照為陽性。
（2）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測LT
將被檢菌株按五點(diǎn)環(huán)形接種于E1ek氏培養(yǎng)基上。以同樣操作，共做兩份，于36℃培養(yǎng)48h。在每株菌苔上放多粘菌素B紙片，于36℃經(jīng)5h～6h，使腸毒素滲入瓊脂中，在距五點(diǎn)環(huán)形菌苔各5mm處的中央，挖一個(gè)直徑4mm的圓孔，并用一滴瓊脂墊底。在平板的中央孔內(nèi)滴加LT抗毒素30μl，用已知產(chǎn)LT和不產(chǎn)毒菌作對照，經(jīng)15h～20h觀察結(jié)果。在菌斑和抗毒素孔之間出現(xiàn)白色沉淀帶者為陽性，無沉淀帶者為陰性。
（3）乳鼠灌胃試驗(yàn)檢測ST
將被檢菌株接種于Honda氏產(chǎn)毒肉湯內(nèi)，于36℃培養(yǎng)24h，以3000r／min離心30min，取上清液經(jīng)薄膜濾器過濾，加熱60℃30min，每mL濾液內(nèi)加入2％伊文思藍(lán)溶液0.02mL。將此濾液用塑料小管注入1日齡一4日齡的乳鼠胃內(nèi)0.1mL，同時(shí)接種3只～4只，禁食3h～4h后用三氯甲烷麻醉，取出全部腸管，稱量腸管(包括積液)重量及剩余體重。腸管重量與剩余體重之比大于0.09為陽性，0.07—0.09為可疑。
食品中病原菌的檢驗(yàn)主要包括食品原料及食品中各種病原菌的檢驗(yàn)，如金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、肉毒梭菌及毒素、巴氏桿菌等19種病原菌。今天小編就只和大家分享大腸希氏菌的檢驗(yàn)。其他的小伙伴們繼續(xù)關(guān)注，小編會(huì)陸續(xù)更新的哦！