一、目的要求
1．學(xué)習(xí)掌握細(xì)菌細(xì)胞壁的染色法。
2．利用質(zhì)壁分離法觀察細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜。
二、基本原理
細(xì)菌細(xì)胞壁很薄，革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁為20—30nm，革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁為10—13nm。組成細(xì)菌細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分是肽聚糖，它與染料結(jié)合的能力差，不易著色，在細(xì)菌的染色過程中，一般情況染料都是通過細(xì)胞壁的滲透、擴(kuò)散等作用而進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞壁本身并未染色，因此，欲通過染色來觀察細(xì)胞壁，必須設(shè)法使細(xì)胞壁能著色，而細(xì)胞質(zhì)則不易著色，常用的方法有單寧酸法和磷鉬酸法。單寧酸和磷鉬酸都是起媒染作用，它們使細(xì)胞壁形成可著色的復(fù)合物，而使細(xì)胞質(zhì)不易被著色，經(jīng)結(jié)晶紫或甲基綠染色后，便可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞壁。
根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞在高滲溶液中或用乙醚蒸氣處理后，會(huì)產(chǎn)生質(zhì)壁分離這一現(xiàn)象，經(jīng)染色后也可在普通光學(xué)顯微鏡下區(qū)分細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜。
三、器材
巨大芽孢桿菌（Bacillus megatherium），枯草芽孢桿菌；
0．2％結(jié)晶紫水溶液，5％單寧酸（鞣酸）水溶液，1％磷鉬酸水溶液，1％甲基綠水溶液，25％NaCl水溶液，0．01％結(jié)晶紫水溶液，Bouin氏固定液，0．1％硫堇（thionine）水溶液，乙醚，乙醚蒸氣瓶等。
四、操作步驟
1．單寧酸法
(1)將培養(yǎng)16—18小時(shí)的巨大芽孢桿菌按常法制成涂片。
(2)用5％單寧酸染5分鐘后，水洗。
(3)用0．2％結(jié)晶紫染3—5分鐘，水洗，吹干。用油鏡觀察，細(xì)胞壁呈紫色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紫色。
2．磷鉬酸法
(1)制備濃厚的涂片，在未干時(shí)浸入1％磷鉬酸水溶液3—5分鐘。
(2)用1％甲基綠水溶液染3—5分鐘。
(3)水洗后，吹干，用油鏡觀察。細(xì)胞壁為綠色，細(xì)胞質(zhì)無色。
3．區(qū)分細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)膜
(1)乙醚蒸氣法
(a)將巨大芽孢桿菌涂布于蓋玻片上，翻轉(zhuǎn)蓋玻片使其放在乙醚蒸氣瓶的瓶口上蒸3分鐘。
(b)取下蓋玻片置Bouin氏固定液中30分鐘后取出，水洗。
(c)用硫堇染色30秒鐘。
(d)水洗，水封，置油鏡下觀察。
(2)NaCl法
(a)取一滴25％NaCl溶液于潔凈的載玻片上。
(b)挑一小環(huán)培養(yǎng)6小時(shí)的枯草芽孢桿菌，在25％NaCl水滴中涂布均勻，待自然干燥。
(c)滴加0．01％結(jié)晶紫于其上，使蓋滿有菌部分，30秒鐘后水洗，干燥，用油鏡觀察結(jié)果。