ATCC菌種霍亂弧菌的檢測方法和性狀！
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2018-10-24 09:21:03
霍亂弧菌檢測方法
生化鑒定
能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖等產(chǎn)酸產(chǎn)氣，遲緩發(fā)酵乳糖。不分解阿拉伯糖、水楊素、衛(wèi)矛醇、鼠李糖、木糖、側(cè)金盞花醇和肌醇。氧化酶、明膠液化試驗陽性。V-P試驗大多數(shù)EL-Tor生物型陽性，而古典生物型大多為陰性。霍亂弧菌能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，同時能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。因此當霍亂弧菌培養(yǎng)在含硝酸鹽的蛋白胨水中，所產(chǎn)生的亞硝酸鹽與吲哚結(jié)合成亞硝基吲哚，滴加濃硫酸即出現(xiàn)薔薇色，稱為霍亂紅試驗陽性 ATCC菌種 。
血清凝集法
根據(jù)弧菌O抗原不同，分成Ⅵ個血清群，第Ⅰ群包括霍亂弧菌的兩個生物型。第Ⅰ群A、B、C三種抗原成份可將霍亂弧菌分為三個血清型：含AC者為原型（又稱稻葉型），含AB者為異型（又稱小川型），A、B、C均有者稱中間型（彥島型）。
1992年10月在印度東南部又發(fā)現(xiàn)了一個引起霍亂流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍亂在臨床表現(xiàn)及傳播方式上與古典型霍亂完全相同，但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集，抗01群的抗血清對0139菌株無保護性免疫。在水中的存活時間較01群霍亂弧菌長，因而有可能成為引起世界性霍亂流行的新菌株，推薦使用天津生物芯片生產(chǎn)的霍亂弧菌診斷血清。
聚合酶鏈反應法
1、普通聚合酶鏈反應法
核酸擴增技術(shù)，即聚合酶鏈式反應（polymerase chainreaction，PCR），其基本原理是設(shè)計、合成兩條寡核苷酸，作為引物，對應于待測病原微生物某一段特異性序列的兩端，然后在體外模擬DNA體內(nèi)復制的過程反復擴增，使靶序列放大上萬倍甚至上百萬倍而被檢測出來。一般選擇霍亂腸毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作為靶基因。一些非產(chǎn)毒株(如環(huán)境來源的菌株)有可能通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得毒力基因成為產(chǎn)毒株，若僅檢測ctx基因容易造成漏檢。因此，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛A基因(tcp A)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達調(diào)控基因(toxR)等也被選用為PcR的靶基因，這大大提高了檢測的特異度.
2、多重PCR法
與常規(guī)PCR相比，多重PCR一次反應可檢測多個基因，節(jié)省了時間和成本。國內(nèi)、外許多學者選用霍亂弧菌的毒素基因ctx、tcp與其他基因如ompW、rfb、hly進行組合，作為共同的靶基因，克服了由于毒力基因特異度不夠高而造成的假陽性。多重PcR同時可準確區(qū)分不同血清型的霍亂弧菌和快速鑒定其是否為產(chǎn)毒株，可謂一舉多得，大大提高了檢測效率。
3、熒光定量PCR法
熒光定量PCR自動化程度高、特異性強、無交叉污染，在霍亂弧菌的快速診斷中得到廣泛應用。尤其是近年來，隨著引物與探針的設(shè)計更精確、多通道熒光PCR儀的開發(fā)與廣泛使用，多重熒光定量PCR技術(shù)日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等優(yōu)點而廣泛應用于病毒、細菌、真菌等多種病原體的快速檢測，成為應用的熱點.
基因芯片
與PCR方法相比，基因芯片技術(shù)能同時獲得更多病原學、生物學方面的信息，從而更為全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]運用基因芯片技術(shù)對多種致病性弧菌的毒力、毒素、耐藥基因及潛在的毒力基因進行全面分析，對掌握這些細菌的致病性及進行有效預防、控制等具有重要意義。但基因芯片成本較高，距離推廣應用尚需時間等待。
性狀
形態(tài)與培養(yǎng)特性
新從病人分離出古典型霍亂弧菌和ELtor弧菌比較典型，為革蘭氏陰性菌，菌體彎曲呈弧狀或逗點狀，菌體一端有單根鞭毛和菌毛，無莢膜與芽胞。經(jīng)人工培養(yǎng)后，易失去弧形而呈桿狀。取霍亂病人米泔水樣糞便作活菌懸滴觀察，可見細菌運動極為活潑，呈流星穿梭運動。在液體培養(yǎng)基內(nèi)常呈單個、成對成鏈狀，有的相連呈S形，甚至螺旋狀。
營養(yǎng)要求不高，在PH8.8～9.0的堿性蛋白胨水或平板中生長良好。因其他細菌在這一PH不易生長，故堿性蛋白胨水可作為選擇性增殖霍亂弧菌的培養(yǎng)基。在堿性平板上菌落直徑為2mm,圓形，光滑，透明。
霍亂弧菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，靛基質(zhì)反應陽性，當培養(yǎng)在含硝酸鹽及色氨酸的培養(yǎng)基中，產(chǎn)生靛基質(zhì)與亞硝酸鹽，在濃硫酸存在時，生成紅色，稱為霍亂紅反應，但其他非致病性弧菌亦有此反應，故不能憑此鑒定霍亂弧菌。EL Tor型霍亂弧菌與古典型霍亂弧菌生化反應有所不同。前者Vp陽性而后者為陰性。前者能產(chǎn)生強烈的溶血素，溶解羊紅細胞，在血平板上生長的菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明溶血環(huán)，古典型霍亂弧菌則不溶解羊紅細胞。個別EL Tor型霍亂弧菌株亦不溶血。
抗原性
根據(jù)弧菌O抗原不同，分成Ⅵ個血清群，第Ⅰ群包括霍亂弧菌的兩個生物型。第Ⅰ群A、B、C三種抗原成份可將霍亂弧菌分為三個血清型：含AC者為原型（又稱稻葉型），含AB者為異型（又稱小川型），A、B、C均有者稱中間型（彥島型）。
抵抗力
霍亂弧菌古典生物型對外環(huán)境抵抗力較弱，EL-Tor生物型抵抗力較強，在河水、井水、海水中可存活1～3周，在鮮魚，貝殼類食物上存活1～2周。
霍亂弧菌對熱，干燥，日光，化學消毒劑和酸均很敏感，耐低溫，耐堿。濕熱55℃，15分鐘，100℃，1～2分鐘，水中加0.5ppm氯15分鐘可被殺死。0.1%高錳酸鉀浸泡蔬菜、水果可達到消毒目的。在正常胃酸中僅生存4分鐘。