今天給大家分享并且交流一下現(xiàn)在國際上一個應(yīng)用在水系統(tǒng)上的新技術(shù)----在線微生物檢測。希望大家感興趣。我們將會從這個幾方面對這個新興的技術(shù)進行介紹，包括新技術(shù)的好處、特點、應(yīng)用在什么地方，以及大家最關(guān)心的法規(guī)部門的態(tài)度和如果使用的話，如何去驗證。
首先，我們需要解決一個問題，既然目前已經(jīng)有現(xiàn)成的并且是法規(guī)支持的微生物檢測技術(shù)，為什么還要用新的方式，它有什么不同？
其實，對于傳統(tǒng)的微生物檢驗，相信大家都非常熟悉了。即通過培養(yǎng)基，在適當?shù)臈l件下，如溫度、時間對微生物進行培養(yǎng)，最終得到可見菌落進行計數(shù)和分析。這種方式已經(jīng)有相當?shù)臍v史了，早在1887年由Koch博士和Petri博士發(fā)明出來，并且沿用至今。是一個在各個微生物相關(guān)領(lǐng)域被大家所熟知的，非常經(jīng)典的方法。對于這種方法，我們一般在一個特定的溫度下對微生物進行培養(yǎng)，通過特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間，最終得到可見菌落（CFU），以此來對微生物水平進行考量。
因為這種方法早在19世紀就開始使用，隨著科學技術(shù)的發(fā)展，尤其是目前自動化生產(chǎn)和控制技術(shù)的飛速發(fā)展，制造的產(chǎn)量和效率都得到了巨大的提高。這種傳統(tǒng)的方式也正在經(jīng)受來自各個方面不同的考驗，比如說它的準確度、適用性、成本等。更多的人和組織也正在尋求更加貼合目前生產(chǎn)條件的新的檢測方法。
OWBA，這個由默克、諾華、百特、羅氏、賽諾菲、輝瑞等多個知名制藥企業(yè)組成的機構(gòu)正在對線微生物檢測方法進行研究和推廣。并且率先讓實時微生物檢測方式實踐于自己的企業(yè)。他們通過多方面的調(diào)研，發(fā)現(xiàn)微生物檢測，尤其是水系統(tǒng)微生物的控制，檢測點數(shù)量之多、頻次之高以及耗材之多，需要耗費相當?shù)娜肆?、物力和財力，成本相對較高。更重要的是，通過離線培養(yǎng)的檢測，得到的結(jié)果是滯后的，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)問題，不僅要啟動調(diào)查機制，而且需要對之前的產(chǎn)品進行處理。否則，如果等到所有結(jié)果都通過后，再放行產(chǎn)品，但是這樣往往又耽誤了必要的上市時間，造成商務(wù)上的損失。陽性結(jié)果也是另外一個問題，它的出現(xiàn)同樣會讓企業(yè)花費更多的精力去進行調(diào)查。而通過調(diào)查，這種傳統(tǒng)的離線微生物培養(yǎng)法，其陽性結(jié)果中，近80%的比例都是假陽性，來源于我們的日常操作以及環(huán)境的影響。
與此同時，F(xiàn)DA鑒于過程分析技術(shù)的創(chuàng)立和應(yīng)該用（PAT），更多的在線設(shè)備被運用到我們的生產(chǎn)過程中以達到實時監(jiān)控的目的，也在致力于在線微生物技術(shù)的推廣。我們已經(jīng)熟知的在線電導(dǎo)率和TOC，尤其是新納入藥典的TOC技術(shù)，就是由此發(fā)展而來的。
而對實驗方法本身，也存在一些問題。我們來看一個例子，在相同濃度的菌液中（100cells/ml），通過培養(yǎng)以后，我們得到的CFU往往是不同的。下面選取了3個比較接近的結(jié)果，分別是41CFU、45CFU和50CFU。
這是什么原因呢？就是因為傳統(tǒng)的方法，采用的是菌落數(shù)（CFU）這一個概念，這個單位其實是一個估計值。因為能形成可見菌落的實際微生物的數(shù)量大相徑庭，往往表面上看似好像是1個菌落，但是到底有多少個微生物？我們很難找到一個關(guān)聯(lián)的關(guān)系。所以，我們用這種方法對實際情況進行說明，可以說是不準確的。這就好比我們看地圖，CFU可能是我們看到的一個一個的城市，但是每個城市里面有多少人口，不知道。而新技術(shù)則檢測出來的是人口的數(shù)量。
況且，還有一些微生物，根本是沒有辦法通過既定條件培養(yǎng)出來的。但是這些微生物卻逃不過在線實時監(jiān)測技術(shù)的眼睛。
當然，美國藥典委（USP）也看到這里面的問題，所以我們目前開始著手逐步推動新的檢測方法。而且，新方法的新的數(shù)量級體系，將會遠遠高于目前我們的傳統(tǒng)觀念。這是一個全新的標準。在USP意識到這個問題之后，他們也提出了相應(yīng)的對策，或者是過渡措施，即允許采用替代方法進行微生物的檢測，那么我們現(xiàn)在給大家介紹的這種在線檢測方式，就是其一。并且方法的原理也是USP中列舉的三大檢測原理之一。
那么，在線微生物檢測的好處在哪里？相比于傳統(tǒng)的離線培養(yǎng)方法，它結(jié)果可靠并且準確，是實測值，不是估計值；在線測量降低了人為假陽性的概率；在線檢測時間短；成本低，一次性投入，基本無后續(xù)耗材。新技術(shù)的特點在于，是一個新的，更為準確的單位體系。自動化程度高，操作簡單，完全可以通過計算機系統(tǒng)進行控制；檢測范圍廣，可以在純化水和注射用水系統(tǒng)上使用。支持多種數(shù)據(jù)傳輸方式，符合21CFR Part11。
至于為什么在線微生物檢測技術(shù)可以拋棄傳統(tǒng)方法的限制，能檢測到幾乎所有的微生物？這就依賴于它涉及的兩大檢測原理，都有非常成熟的應(yīng)用：熒光檢測法和粒子散射檢測。我們運用激光光束對樣品進行照射，從而樣品中被激發(fā)出的熒光和散射光束，收集之后，通過內(nèi)部軟件進行判別。
首先給大家介紹散射原理，通過405nm的激光光束，被照射的樣品中如果存在顆粒（惰性粒子或微生物），在照射原光束會發(fā)生散射，不同的散射角度對應(yīng)不同的粒徑大小。這個技術(shù)在半導(dǎo)體以及微電子領(lǐng)域都有成熟的應(yīng)用，我們都知道，這兩個行業(yè)對粒子的數(shù)量和尺寸都是有這非常嚴格的要求。
其次是熒光檢測。因為活性微生物或者是在微生物的日常生化反應(yīng)中都存在代謝產(chǎn)物，如酪氨酸、色氨酸、NADH以及核黃素，且這些物質(zhì)一般同時存在。而405nm可以激發(fā)NADH和核黃素在更高的波段產(chǎn)生熒光，通過檢測特定波段的熒光，來判斷是否為活的微生物。綜合上述兩種結(jié)果，即同時符合散射標記的粒子大小又符合有相應(yīng)波長的熒光反應(yīng)，當這兩個結(jié)果都存在的條件下，可以判定粒子是微生物，否則即為惰性粒子。
所以，我們可以看一下，這兩個通道產(chǎn)生的信號反饋，疊加之后，在同一時間，都出現(xiàn)信號相應(yīng)的時候，我們判斷其為微生物。
在了解了所有的背景知識之后，我們應(yīng)該把在線微生物設(shè)備安裝在什么地方呢？其實安裝方法和安裝位置可以參考在線TOC。一般的公認的監(jiān)測點至少應(yīng)該是使用點之后的總回水管上。該點的微生物水平可以代表整個環(huán)路的最差條件?；蛘吒鶕?jù)用戶的自身需要，自己設(shè)置監(jiān)控點。除此之外，還可以把設(shè)備安裝在移動平臺上，對每個用水點進行在線監(jiān)控。
接下來我們來看一下法規(guī)方面的要求。
在開始我們也提到了，諸如FDA, USP等機構(gòu)，均在法規(guī)或者指導(dǎo)文件中提及在線微生物檢測方法。說明這種方法相對與傳統(tǒng)方法而言，是切實可行的，只不過目前還沒有明確的記入相關(guān)條款，要使用它們，我們還需要前期進行一些工作。
為什么沒有馬上進行改革？其中一個非常重要的原因在于微生物的根本特性。以USP為例，我們可以看到，諸如像電導(dǎo)率，pH等依靠化學分析的方法，都歸類在實驗章節(jié)。而實驗章節(jié)的很多檢測項目，都是可以用SOP確定下來的，是一種非常準確的定量的方式，有明確的檢測法和檢驗標準。而微生物相關(guān)的檢測手段只是記錄在通則中，正是因為對于微生物沒有人能明確規(guī)定方法對其進行檢測，它具有不確定性和多樣性。因此，如果我們要用新的方式去對微生物進行檢測的話，前期需要做適當?shù)尿炞C。
歐盟（EP 5.1.6）和美國藥典（USP1223），都有相應(yīng)的通則指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)進行驗證，并且明確只要通過驗證，替代傳統(tǒng)方式的微生物檢測方式是可以被接受的。這也正是我們的現(xiàn)狀。而我們國家藥典通則9201，亦如是說。
最后，給大家分享一些我們目前正在進行的關(guān)于驗證方法的一些研究。通過對各國藥典相應(yīng)章節(jié)的解讀，我們推薦了2種對可替代微生物檢測方式的驗證手段：在線和離線。方法1是在線方式，應(yīng)該也是生產(chǎn)企業(yè)比較樂于接受的方式，因為這種方式直接代表了我們?nèi)粘５纳a(chǎn)條件，并且我們不用引入外來的菌種進行測試。簡單的說，我們只需要選擇好檢測位點，做好前期的設(shè)備確認工作，為驗證工作制定專門的SOP，包括我們的取樣頻率和數(shù)量。最后對在在線方式和離線方式兩種方法做相應(yīng)的分析和對比即可。方法2是離線方法，多適用于實驗室。即用配制樣品的方式，人為選取若干菌種和濃度梯度進行檢測，最后對比結(jié)果。具體的菌種選測和濃度梯度，以及同一濃度的樣品數(shù)目均可以參考藥典上相應(yīng)的方法。兩種方式各有利弊。
總的來說，我們從對制藥用水幾大參數(shù)的檢測方法的發(fā)展可以看出，在初期，我們也是用比較原始的方法去檢測諸如TOC等參數(shù)，之后我們發(fā)明了儀器測量法，而后我們又把離線的儀器測量法升級為目前的在線監(jiān)控，最終寫入法規(guī)作為我們目前的通用標準。對于微生物也是一樣的，只不過因為復(fù)雜程度比較高，導(dǎo)致起步比較晚，但是請相信，它必定會沿襲這個方向，最終成為順應(yīng)時代發(fā)展的檢測手段。
新的技術(shù)需要我們的共同努力去實踐從而變成現(xiàn)實，以此來提高我們的水平和工作效率，確保制藥過程的穩(wěn)定和高效以及安全。