質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。而在現(xiàn)在的分子生物學(xué)試驗(yàn)中我們會(huì)涉及到各式各樣的質(zhì)粒，而接觸到質(zhì)粒時(shí)不可避免的就會(huì)涉及到質(zhì)粒的抽提。由于質(zhì)粒抽提成本不高，因此大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室都選擇了用公司提供的抽提試劑盒來抽提質(zhì)粒，這也就導(dǎo)致了很多人并不是很了解質(zhì)粒抽提的原理。
質(zhì)粒抽提試劑盒基本用的都是堿裂解法，因此我們就來了解一下這類試劑盒的抽提原理。
這類試劑盒中都會(huì)有提供主要的三種溶液，當(dāng)然每個(gè)試劑公司都會(huì)有不同的命名，我們就按加入順序命名為溶液1，溶液2，溶液3
溶液1
主要成分50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0。主要的作用是用來重懸沉淀的菌體。其中葡萄糖的作用其實(shí)只是為了不讓重懸的菌體過快的下沉。Tris-Cl其實(shí)就是一種緩沖液，可以使溶液pH值穩(wěn)定在8左右。EDTA的作用主要是為了抑制DNase的活性,以及抑制菌體生長(zhǎng)。當(dāng)然溶液1中還需要加入RNaseA，用來去除抽提過程中的RNA污染。其實(shí)這樣看來溶液1的作用其實(shí)只是起到了穩(wěn)定重懸的作用。當(dāng)然重懸一定要充分，不能看到一點(diǎn)的塊狀，目的就是要將菌體充分打散。
溶液2
主要成分0.2NNaOH/1%SDS。溶液2也可以被稱為裂解液，所謂堿裂解法的堿就是這里的NaOH。NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。那SDS是干啥用的呢，其實(shí)這一步的裂解SDS并沒有發(fā)揮什么作用，主要是為了下一步蛋白沉淀所做的鋪墊。在裂解這一步驟中所有的試劑盒都會(huì)寫到輕微顛倒混勻，以及不要反映超過5分鐘，雖然NaOH有裂解細(xì)胞的作用，但是劇烈混勻或是裂解時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致NaOH將細(xì)菌中的基因組染色體打開并打斷，這樣就會(huì)導(dǎo)致基因組DNA溶解到裂解液中，并且后期無法將二者分開，這就造成最后的質(zhì)粒會(huì)有基因組污染。
溶液3
主要成分3M醋酸鉀/2M醋酸。既然長(zhǎng)時(shí)間的堿性環(huán)境會(huì)導(dǎo)致基因組污染，那就用酸中和一下，這里的醋酸就是起到中和NaOH的作用的。而這一步的白色絮狀沉淀又是怎么來的呢。還記得溶液2中的SDS嗎，這其實(shí)是十二烷基磺酸鈉（SDS）遇到鉀離子后變成了十二烷基磺酸鉀（potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。而SDS又有結(jié)合蛋白質(zhì)的能力，因此這樣就能將菌體中的蛋白質(zhì)都沉淀下來了。
加完了以上三個(gè)溶液后就能通過離心將基因組染色體以及蛋白沉淀下來，上清中就含有目的質(zhì)粒，接下來就是將上清過柱，該步驟的目的就是清洗以及回收質(zhì)粒DNA。
通過上面的介紹我們不難發(fā)現(xiàn)其實(shí)最重要的是溶液2。質(zhì)粒抽提得率低大多也和這一步有很大的關(guān)系。那么溶液2會(huì)帶來哪些問題：
首先溶液2不能長(zhǎng)時(shí)間開蓋暴露在空氣中，因?yàn)镃O2會(huì)和NaOH反應(yīng)變成堿性較弱的Na2CO3這樣會(huì)使得裂解的效果變差，因此如果溶液2是一大瓶的話，最好是將其分裝幾瓶。
在低溫時(shí)溶液2會(huì)產(chǎn)生沉淀，這是由于SDS析出，只需37度溫浴片刻即可。
最后在加入溶液2后一定要確保溶液變得澄清，溶液澄清就說明細(xì)胞裂解完全，反之則不充分，而裂解不充分則會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒的抽提得率低，因此在使用的菌體起始量高時(shí)需要加大這3個(gè)溶液的用量以確保菌液徹底裂解。