幾種菌種的保存
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2016-12-23 09:29:02
定期移植法
亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，包括斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等。是指將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長充分后，于4～6℃進行保存并間隔一定時間進行移植培養(yǎng)的菌種保藏方法。
操作步驟如下：
1.培養(yǎng)基制備
1.1器皿準備
培養(yǎng)基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如，三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，經(jīng)洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。
1.2溶解培養(yǎng)基配料
先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱取各項材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，攪拌均勻。
1.3調(diào)pH值
配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)要求加稀酸（0.1mol/L鹽酸）或稀堿(10%氫氧化鈉)調(diào)pH值。加酸或堿液時要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導致測量不準確和營養(yǎng)成分被破壞。
1.4加凝固劑
配制固體培養(yǎng)基時需加凝固劑，如，瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補足所蒸發(fā)水分。
1.5過濾分裝
在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過濾并分裝。斜面培養(yǎng)基分裝量約為試管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培養(yǎng)基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。
1.6包扎標記
將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。
1.7滅菌
根據(jù)要求將培養(yǎng)基滅菌，通常蒸汽滅菌為121℃，15～20min。
1.8斜面擺放
滅菌后及時擺放斜面，斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。
1.9無菌檢查
將滅菌的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無菌檢驗，通常30℃培養(yǎng)1～3天。無菌檢查合格后將其保存于4℃下備用。
2.接種
2.1斜面接種
2.1.1點接
把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如，毛霉、根霉等）。
2.1.2中央劃線
從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細菌和酵母菌等。
2.1.3稀波狀蜿蜒劃線法
從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴散的細菌，也適用于部分真菌。
2.1.4密波狀蜿蜒劃線法
從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細胞，適用于細菌和酵母菌等。
2.1.5挖塊接種法
挖取菌絲體連同少量培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔子菌類真菌。
2.2穿刺接種
用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細菌和酵母菌等。
2.3液體接種
挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。
3.培養(yǎng)
將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細胞穩(wěn)定期或得到成熟孢子。細菌培養(yǎng)溫度一般為30～37℃，真菌培養(yǎng)溫度一般為25～28℃。
4.保藏
培養(yǎng)好的菌種于4～6℃保存，根據(jù)要求每3～6個月移植一次。某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須1～3個月移植一次。
保藏濕度用相對濕度表示，通常為50%～70%。
斜面菌種應保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對照，防止因意外和污染造成損失。
液體石蠟保藏法
亦稱礦物油保藏法,定期移植保藏法的輔助方法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至菌種長出健壯菌落后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫（4～6℃）干燥處進行保存的一種菌種保藏方法。
操作步驟如下：
1.液體石蠟的準備
選用優(yōu)質(zhì)化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進行滅菌：
121℃濕熱滅菌30min，置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。
160℃干熱滅菌2個小時，冷卻后，經(jīng)無菌檢查后備用。
2.斜面培養(yǎng)物的制備
參照定期移植法。
3.灌注石蠟
將無菌的液體石蠟在無菌條件下注入培養(yǎng)好的新鮮斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。
4.保藏
4.1注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態(tài)置低溫（4～6℃）干燥處保藏，保藏時間2～10年。
4.2保藏期間應定期檢查，如，培養(yǎng)基露出液面，應及時補充無菌的液體石蠟。
5.恢復培養(yǎng)
恢復培養(yǎng)時，挑取少量菌體轉(zhuǎn)接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長繁殖后，再重新轉(zhuǎn)接一次。
沙土管保藏法
是載體保藏法的一種。將培養(yǎng)好的微生物細胞或孢子用無菌水制成懸浮液,注入滅菌的沙土管中混合均勻，或直接將成熟孢子刮下接種于滅菌的沙土管中，使微生物細胞或孢子吸附在沙土載體上，將管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4～6℃或室溫進行保存的一種菌種保藏方法。
操作步驟如下：
1.沙土管制備
將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質(zhì)，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質(zhì)，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機物較多可用20%鹽酸浸泡。24小時后倒去鹽酸，用水洗泡數(shù)次至中性，將沙子烘干或曬干。
另取地面下40～60cm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100目過篩，水洗至中性，烘干。
將處理后的沙、土按質(zhì)量比2∶1混合。混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃濕熱滅菌30min。
隨機抽取滅菌后的砂土管若干支，無菌條件下取少許砂土至營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24小時，檢查無微生物生長后方可使用。
2.斜面培養(yǎng)物的制備
參照定期移植法。
3.制備菌懸液
向培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物中注入3～5mL無菌水，洗下細胞或孢子制成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。
4.干燥
真空抽去沙土管中水分。
5.保藏
將沙土管用火焰熔封后存放于低溫(4～6℃)干燥處保藏，每隔半年檢查一次菌種存活性及純度?；?qū)⑸惩凉苤苯佑门Ｆぜ埢蛩芰霞埌?，置干燥器?nèi)保存，保藏時間2～10年。
6.恢復培養(yǎng)
無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，長出菌落后再轉(zhuǎn)接一次?；蛉∩惩亮Ｓ谶m宜的液體培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)接斜面。
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