孟加拉紅培養(yǎng)基的使用方法與核心注意事項(xiàng)及結(jié)果判讀！
小楊 / 2026-01-09 09:37:14
孟加拉紅培養(yǎng)基的規(guī)范使用是確保真菌分離與計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵，需嚴(yán)格遵循“制備 - 滅菌 - 接種 - 培養(yǎng) - 觀察”的流程，并注意操作細(xì)節(jié)以避免污染或結(jié)果偏差。以下是具體的使用方法和核心注意事項(xiàng)。
一、孟加拉紅培養(yǎng)基的使用方法
（一）培養(yǎng)基制備（以干粉培養(yǎng)基為例，按說明書比例配置）
1、稱量與溶解
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求（如制備 1000mL 培養(yǎng)基），準(zhǔn)確稱取孟加拉紅培養(yǎng)基干粉（通常每 1000mL 需 36-40g，具體參照不同廠家說明書），加入到適量去離子水或蒸餾水（如 800mL）中。
用玻璃棒攪拌均勻，置于水浴鍋或電爐（小火）上加熱煮沸，期間持續(xù)攪拌，直至干粉完全溶解（無肉眼可見顆粒），避免局部過熱導(dǎo)致成分碳化。
2、定容與調(diào) pH
將溶解后的培養(yǎng)基冷卻至室溫（或 40-50℃），補(bǔ)加蒸餾水至目標(biāo)體積（如 1000mL）。
用 pH 計(jì)或精密 pH 試紙檢測(cè) pH 值，需調(diào)節(jié)至5.0-5.5（真菌最適酸性環(huán)境）：若 pH 偏高，滴加 1mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)；若 pH 偏低，滴加 1mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)后需攪拌均勻并重新檢測(cè) pH。
3、分裝與滅菌
將調(diào)好 pH 的培養(yǎng)基分裝至錐形瓶（或培養(yǎng)皿，若需預(yù)倒平板），錐形瓶裝量不超過容積的 1/2（避免滅菌時(shí)溢出），并加蓋棉塞或硅膠塞，外包牛皮紙。
采用高壓蒸汽滅菌：121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²）條件下滅菌 15-20 分鐘（滅菌時(shí)間過長(zhǎng)可能破壞培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分，過短則滅菌不徹底）。
4、倒平板（關(guān)鍵步驟）
滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至45-50℃（手觸錐形瓶外壁不燙手為宜），若需添加氯霉素（可選，增強(qiáng)抑細(xì)菌效果），需先將氯霉素溶液（無菌過濾后，終濃度通常為 50μg/mL）加入培養(yǎng)基中，輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）。
在超凈工作臺(tái)內(nèi)，打開培養(yǎng)皿（直徑 90mm 為宜），倒入培養(yǎng)基約 15-20mL /皿，迅速蓋上皿蓋，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使培養(yǎng)基均勻鋪滿底部，避免邊緣產(chǎn)生氣泡。
待培養(yǎng)基自然凝固（室溫放置 30-60 分鐘，或 4℃冰箱放置 15 分鐘加速凝固），標(biāo)記培養(yǎng)基名稱、制備日期，備用（4℃冰箱可保存 1-2 周，使用前需室溫平衡 30 分鐘）。
（二）樣品接種與培養(yǎng)
1、樣品預(yù)處理（根據(jù)樣品類型調(diào)整）
液體樣品（如果汁、飲用水）：取 10mL 樣品直接加入 90mL 無菌生理鹽水（或緩沖液）中，進(jìn)行梯度稀釋（如 10?¹、10?²、10?³，根據(jù)污染程度選擇稀釋度）。
固體樣品（如面包、肉制品）：稱取 10g 樣品，加入 90mL 無菌生理鹽水，用均質(zhì)器均質(zhì) 1-2 分鐘制成 10?¹ 勻漿，再進(jìn)行梯度稀釋。
藥品/環(huán)境樣品：按《中國(guó)藥典》或?qū)?yīng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品處理，確保樣品均勻分散。
2、接種操作（涂布法或傾注法，常用傾注法計(jì)數(shù)）
傾注法（適用于真菌計(jì)數(shù)）：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取 1mL 稀釋后的樣品（每個(gè)稀釋度做 3 個(gè)平行），加入到無菌空培養(yǎng)皿中，隨后將冷卻至 45-50℃的孟加拉紅培養(yǎng)基（避免燙傷樣品中的真菌）倒入培養(yǎng)皿（約 15mL /皿），輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使樣品與培養(yǎng)基充分混合，待培養(yǎng)基凝固。
涂布法（適用于真菌分離純化）：取 0.1mL 稀釋樣品滴在已凝固的孟加拉紅培養(yǎng)基平板中央，用無菌涂布棒（蘸取少量無菌生理鹽水濕潤(rùn)，避免刮傷培養(yǎng)基）將樣品均勻涂布在整個(gè)平板表面，待樣品吸收后再培養(yǎng)。
3、培養(yǎng)條件控制
將接種后的平板倒置（避免冷凝水滴落污染菌落），放入25-28℃恒溫培養(yǎng)箱中需氧培養(yǎng)。
培養(yǎng)時(shí)間：酵母菌通常 2-3 天可觀察到明顯菌落，霉菌需 3-5 天（若菌落生長(zhǎng)緩慢，可延長(zhǎng)至 7 天，但需避免過度培養(yǎng)導(dǎo)致菌落重疊）。
（三）結(jié)果觀察與記錄
1、菌落識(shí)別
參照前文“典型培養(yǎng)現(xiàn)象”，區(qū)分酵母菌（圓形、粉紅色、光滑菌落）和霉菌（絨毛狀/粉末狀、顏色多樣，如青綠色、黑色），忽略微小、透明的細(xì)菌菌落（被抑制的細(xì)菌）。
2、計(jì)數(shù)與記錄
選擇菌落數(shù)在 10-150 個(gè)之間的平板（符合微生物計(jì)數(shù)的“有效平板”標(biāo)準(zhǔn)），計(jì)算同一稀釋度 3 個(gè)平行平板的平均菌落數(shù)，再根據(jù)稀釋倍數(shù)換算成樣品中真菌的數(shù)量（單位：CFU/g 或 CFU/mL）。
記錄菌落形態(tài)（大小、顏色、質(zhì)地）、生長(zhǎng)速度，必要時(shí)挑取典型菌落進(jìn)行顯微鏡鑒定（如觀察霉菌的孢子梗、酵母菌的細(xì)胞形態(tài)）。
二、核心注意事項(xiàng)
（一）培養(yǎng)基制備相關(guān)注意事項(xiàng)
1、干粉溶解：避免碳化與沉淀
加熱溶解時(shí)需小火攪拌，不可直接煮沸未溶解的干粉，否則蛋白胨、葡萄糖易碳化，導(dǎo)致培養(yǎng)基顏色變深（呈深褐色），影響菌落觀察；若溶解后有少量沉淀，需過濾后再滅菌（避免沉淀干擾菌落計(jì)數(shù)）。
2、pH 調(diào)節(jié)：嚴(yán)格控制酸性范圍
pH 值是孟加拉紅培養(yǎng)基選擇性的關(guān)鍵：若 pH＞5.5，酸性環(huán)境減弱，細(xì)菌抑制效果下降，可能出現(xiàn)細(xì)菌污染；若 pH＜5.0，會(huì)抑制部分真菌（如某些酵母菌）生長(zhǎng)，導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏低。調(diào)節(jié) pH 時(shí)需緩慢滴加酸堿溶液，避免 pH 劇烈波動(dòng)。
3、滅菌與冷卻：防止成分破壞
不可采用干熱滅菌（會(huì)破壞培養(yǎng)基中的有機(jī)成分），必須用高壓蒸汽滅菌，且滅菌時(shí)間不可超過 20 分鐘（否則葡萄糖可能分解為有害物質(zhì)，抑制真菌生長(zhǎng)）；倒平板時(shí)溫度不可過高（＞60℃會(huì)殺死樣品中的真菌），也不可過低（＜40℃會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基提前凝固，無法均勻混合）。
（二）樣品接種與培養(yǎng)相關(guān)注意事項(xiàng)
1、無菌操作：避免外源污染
所有操作（稱量、溶解、分裝、接種）需在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作人員需戴無菌手套、口罩，接種工具（涂布棒、移液管）需滅菌（涂布棒可灼燒滅菌，冷卻后使用，避免燙傷樣品）；培養(yǎng)皿開封后，皿蓋不可倒扣在臺(tái)面，避免空氣中的真菌孢子污染。
2、稀釋度選擇：確保計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性
樣品稀釋度需合理：若稀釋度過低（如 10?¹），菌落可能重疊（無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)）；若稀釋度過高（如 10??），平板上菌落數(shù)過少（＜10 個(gè)，誤差較大）。建議根據(jù)樣品污染程度預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇 2-3 個(gè)合適的稀釋度。
3、培養(yǎng)條件：嚴(yán)格控制溫度與時(shí)間
溫度不可高于 30℃（否則霉菌菌絲生長(zhǎng)過快，菌落擴(kuò)散；酵母菌可能因溫度過高抑制生長(zhǎng)），也不可低于 22℃（生長(zhǎng)緩慢，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間）；培養(yǎng)時(shí)間不可過短（霉菌孢子未成熟，無法識(shí)別），也不可過長(zhǎng)（菌落過度擴(kuò)散，甚至污染雜菌）。
（三）結(jié)果判斷與安全相關(guān)注意事項(xiàng)
1、菌落區(qū)分：避免誤判
部分耐酸性細(xì)菌（如
乳酸菌）可能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，形成微小、乳白色菌落，需結(jié)合顯微鏡觀察（細(xì)菌為單細(xì)胞，無菌絲；真菌有菌絲或假菌絲），避免誤計(jì)入真菌數(shù)量。
2、安全防護(hù)：防止真菌污染
霉菌培養(yǎng)過程中可能產(chǎn)生孢子，操作時(shí)需在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，避免孢子擴(kuò)散至空氣中（引起呼吸道不適）；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有用過的培養(yǎng)基需高壓滅菌（121℃，30 分鐘）后再丟棄，避免環(huán)境污染。
3、培養(yǎng)基保存：避免變質(zhì)
制備好的平板需密封，4℃冰箱保存，避免水分流失（培養(yǎng)基干裂，影響真菌生長(zhǎng)）；保存時(shí)間不可超過 2 周，若平板出現(xiàn)霉斑、變色（如粉紅色變淺），需丟棄，不可使用。
綜上，
孟加拉紅培養(yǎng)基的使用需嚴(yán)格遵循無菌操作和標(biāo)準(zhǔn)化流程，重點(diǎn)控制培養(yǎng)基 pH、滅菌條件、接種稀釋度及培養(yǎng)環(huán)境，才能確保真菌分離與計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
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