蠟樣芽胞桿菌的特異性分子生物學(xué)方法及技術(shù)細(xì)節(jié)有哪些？
小楊 / 2025-12-18 09:34:29
蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）的特異性分子生物學(xué)方法，核心是基于菌株特異性基因或毒力基因的檢測(cè)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)快速、精準(zhǔn)的菌種鑒定，同時(shí)還能評(píng)估菌株的致病性。以下是目前主流的特異性分子生物學(xué)方法及技術(shù)細(xì)節(jié)：
一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及衍生技術(shù)
這是最常用、最成熟的分子鑒定方法，核心是針對(duì)
蠟樣芽胞桿菌的特異性保守基因或毒力相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)及大小判定結(jié)果。
1、常規(guī) PCR（終點(diǎn) PCR）
靶標(biāo)基因選擇
保守看家基因：用于菌種的分類鑒定，區(qū)分于其他芽孢桿菌
16S rRNA 基因：芽孢桿菌屬的通用鑒定基因，
蠟樣芽胞桿菌的 16S rRNA 序列與同屬菌株（如
枯草芽孢桿菌）有差異，測(cè)序比對(duì)后可確證；但分辨率有限，常需結(jié)合其他基因。
gyrB 基因（促旋酶 B 亞基基因）：進(jìn)化速率快于 16S rRNA，是芽孢桿菌種級(jí)鑒定的核心靶標(biāo)，特異性高于 16S rRNA。
rpoB 基因（RNA 聚合酶 β 亞基基因）：序列保守性適中，可有效區(qū)分蠟樣芽胞桿菌與近緣種（如
炭疽芽孢桿菌、
蘇云金芽孢桿菌）。
毒力相關(guān)基因：同時(shí)鑒定菌種和致病性，適用于食品或臨床樣本
腸毒素基因：如溶血素 BL 基因、非溶血性腸毒素基因、腸毒素 FM 基因，幾乎所有致病性蠟樣芽胞桿菌均攜帶這些基因。
嘔吐毒素基因：cesA/cesB（
蠟樣芽胞桿菌毒素基因），僅產(chǎn)嘔吐毒素的菌株攜帶，是食源性嘔吐型中毒菌株的特異性標(biāo)志。
技術(shù)流程：提取菌株基因組 DNA → 特異性引物擴(kuò)增 → 瓊脂糖凝膠電泳 → 觀察目標(biāo)條帶大小。
優(yōu)勢(shì)：操作簡(jiǎn)單、成本低、特異性強(qiáng)，適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)。
2、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）
原理：在常規(guī) PCR 基礎(chǔ)上加入熒光探針或染料，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程，通過(guò) Ct 值判定靶標(biāo)基因的存在，還可實(shí)現(xiàn)定量分析。
應(yīng)用場(chǎng)景：適用于復(fù)雜樣本的快速檢測(cè)，可直接檢測(cè)未分離培養(yǎng)的樣本，縮短檢測(cè)時(shí)間至 2~4h。
特異性探針設(shè)計(jì)：針對(duì)gyrB或毒力基因的特異性序列設(shè)計(jì) TaqMan 探針，進(jìn)一步提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，避免非特異性擴(kuò)增的干擾。
多重 PCR
原理：在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)基因。
優(yōu)勢(shì)：一次反應(yīng)即可完成菌種鑒定 + 致病性評(píng)估，大幅提高檢測(cè)效率，適合大規(guī)模樣本篩查。
二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）
原理：針對(duì)靶基因的 6 個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì) 4 條引物，在等溫條件（60~65℃）下，利用鏈置換 DNA 聚合酶實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)基因的快速擴(kuò)增，產(chǎn)物可通過(guò)肉眼觀察渾濁度或熒光顯色判定。
靶標(biāo)選擇：常選用gyrB、nheA等特異性基因。
優(yōu)勢(shì)：無(wú)需昂貴的 PCR 儀，操作簡(jiǎn)便、擴(kuò)增速度快（30~60min 完成）、特異性高，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
局限性：引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，需嚴(yán)格優(yōu)化反應(yīng)條件。
三、核酸測(cè)序技術(shù)
該技術(shù)是分子鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)測(cè)定靶基因或全基因組序列，實(shí)現(xiàn)高精度的種級(jí)鑒定和菌株分型。
1、靶向基因測(cè)序
方法：對(duì) PCR 擴(kuò)增的特異性基因進(jìn)行 Sanger 測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI 等數(shù)據(jù)庫(kù)中的蠟樣芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株序列比對(duì)。
判定標(biāo)準(zhǔn)：序列同源性≥99% 即可確認(rèn)為蠟樣芽胞桿菌；同源性較低時(shí)，可結(jié)合多個(gè)基因序列進(jìn)行多基因序列分析（MLSA）。
2、全基因組測(cè)序（WGS）
方法：對(duì)菌株的全基因組 DNA 進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)基因組組裝、基因注釋和比較基因組分析，確定菌株的分類地位。
優(yōu)勢(shì)：分辨率最高，不僅能鑒定菌種，還能分析菌株的進(jìn)化關(guān)系、毒力基因簇、耐藥基因等，適用于流行病學(xué)調(diào)查。
局限性：成本高、數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，需專業(yè)的生物信息學(xué)平臺(tái)支持。
四、其他分子分型技術(shù)
這類技術(shù)主要用于菌株的分子分型，輔助流行病學(xué)研究，區(qū)分不同來(lái)源的蠟樣芽胞桿菌菌株：
脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）：通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化基因組 DNA，利用脈沖場(chǎng)電泳分離不同大小的 DNA 片段，形成特異性指紋圖譜。該技術(shù)是芽孢桿菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可用于追蹤菌株的傳播路徑。
多位點(diǎn)序列分型（MLST）：基于 7 個(gè)管家基因的序列變異進(jìn)行分型，結(jié)果可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，實(shí)現(xiàn)全球范圍內(nèi)的菌株同源性分析。
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