酪胨瓊脂培養(yǎng)基的使用原理及常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法！
小楊 / 2025-12-09 10:02:39
酪胨瓊脂培養(yǎng)基是微生物學(xué)中常用的非選擇性基礎(chǔ)培養(yǎng)基，核心作用是為細(xì)菌、真菌等微生物提供營(yíng)養(yǎng)支持，用于微生物的分離、純化、計(jì)數(shù)及培養(yǎng)特征觀察（如菌落形態(tài)、色素產(chǎn)生等）。其設(shè)計(jì)核心圍繞“營(yíng)養(yǎng)全面性”和“物理穩(wěn)定性”，以下從使用原理、核心成分、使用方法及注意事項(xiàng)展開(kāi)詳細(xì)說(shuō)明：
一、使用原理
1、營(yíng)養(yǎng)供給原理
微生物生長(zhǎng)需碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，酪胨瓊脂的成分精準(zhǔn)匹配這一需求：
氮源核心：酪胨是牛奶酪蛋白經(jīng)蛋白酶水解得到的混合物，含多種游離氨基酸、肽類(lèi)，能被大多數(shù)微生物直接吸收，滿(mǎn)足蛋白質(zhì)合成、酶類(lèi)合成的需求（適用于絕大多數(shù)異養(yǎng)微生物，包括革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌、酵母菌等）。
碳源與能量：培養(yǎng)基中添加的葡萄糖、乳糖等糖類(lèi)，為微生物提供代謝能量和碳骨架；部分配方中含酵母提取物，可補(bǔ)充維生素 B 族、生長(zhǎng)因子，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型微生物生長(zhǎng)。
物理支撐：瓊脂作為凝固劑（添加量 1.5%-2.0%），在 95℃以上溶解、40℃以下凝固，凝固后形成多孔的固體基質(zhì)，既固定微生物位置（便于形成單菌落），又能讓營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物自由擴(kuò)散，同時(shí)不被微生物分解利用（穩(wěn)定性強(qiáng)）。
2、應(yīng)用邏輯
作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其不含抑制劑（如膽鹽、染料），也無(wú)選擇性成分，對(duì)微生物無(wú)篩選作用，僅提供“通用營(yíng)養(yǎng)平臺(tái)”：
適用于未知微生物的初步分離（如環(huán)境樣品、臨床標(biāo)本中的微生物富集）；
用于純培養(yǎng)物的傳代、保藏（維持微生物活性和穩(wěn)定性）；
觀察微生物的菌落形態(tài)（大小、形狀、顏色、邊緣、隆起度），為菌種鑒定提供依據(jù)。
二、核心成分（典型配方，按 1L 蒸餾水計(jì)）
成分 含量 作用
酪胨 10-15g 提供氮源、氨基酸、肽類(lèi)
葡萄糖/乳糖 1-5g 提供碳源和能量
酵母提取物 2-5g 補(bǔ)充維生素、生長(zhǎng)因子
瓊脂 15-20g 凝固劑，形成固體培養(yǎng)基
氯化鈉 5g 維持滲透壓，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝
蒸餾水 1000mL 溶劑，維持體系平衡
三、使用方法（完整流程：制備→滅菌→接種→培養(yǎng)→觀察）
1、培養(yǎng)基制備（關(guān)鍵：溶解完全、pH 準(zhǔn)確）
稱(chēng)量：按配方精準(zhǔn)稱(chēng)取各成分（酪胨、糖類(lèi)、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂），放入錐形瓶中。
溶解：加入 1000mL 蒸餾水，攪拌均勻；將錐形瓶置于沸水浴或電熱爐上加熱，邊加熱邊攪拌，直至瓊脂完全溶解（溶液澄清，無(wú)白色顆粒），避免局部過(guò)熱焦糊。
調(diào) pH：冷卻至 50-60℃（不燙手），用 pH 計(jì)測(cè)量，用鹽酸（調(diào)低）或氫氧化鈉（調(diào)高）將 pH 調(diào)至 7.2-7.4（細(xì)菌最適 pH）；若培養(yǎng)真菌，可調(diào)至 5.5-6.0。
分裝：將溶解好的培養(yǎng)基分裝至試管或培養(yǎng)皿（分裝量：試管約 1/4 體積，培養(yǎng)皿約 20mL /皿），分裝時(shí)避免培養(yǎng)基沾到管口/皿口（防止污染）。
加塞/封蓋：試管加硅膠塞或棉塞（透氣且防污染），培養(yǎng)皿暫時(shí)松開(kāi)蓋子（滅菌時(shí)排出蒸汽）。
2、滅菌（核心：殺滅所有雜菌，保證無(wú)菌環(huán)境）
采用高壓蒸汽滅菌法：將分裝后的培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌鍋，121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²）下滅菌 15-20 分鐘（殺滅芽孢、孢子等耐高溫微生物）。
滅菌后取出：試管立即傾斜放置（制成“斜面培養(yǎng)基”，增大接種面積），培養(yǎng)皿平放冷卻（待瓊脂凝固，形成平板）。
3、無(wú)菌檢查（避免滅菌失敗導(dǎo)致污染）
將滅菌后的培養(yǎng)基（斜面或平板）置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24-48 小時(shí)，觀察是否有雜菌菌落生長(zhǎng)。
若無(wú)菌落，說(shuō)明滅菌合格；若有雜菌，需重新制備并滅菌。
4、接種與培養(yǎng)（按實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇接種方式）
接種前準(zhǔn)備：超凈工作臺(tái)紫外線(xiàn)消毒 30 分鐘，接種工具（接種環(huán)、涂布棒）用酒精燈灼燒滅菌（冷卻后使用，避免燙死微生物）。
接種方式：
分離單菌落：采用“稀釋涂布平板法”（將樣品梯度稀釋后，取 0.1mL 涂布于平板表面）或“平板劃線(xiàn)法”（接種環(huán)蘸取樣品后在平板上劃線(xiàn)，逐步稀釋微生物）。
純培養(yǎng)傳代：用接種環(huán)挑取單菌落，劃線(xiàn)接種至斜面培養(yǎng)基或平板。
計(jì)數(shù)：采用稀釋涂布平板法，接種后培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)（換算成樣品中微生物濃度）。
培養(yǎng)條件：
真菌：25-28℃培養(yǎng) 48-72 小時(shí)（如
酵母菌、
霉菌）。
5、觀察與記錄
培養(yǎng)結(jié)束后，觀察菌落形態(tài)（大小、形狀、顏色、邊緣、透明度、隆起度）、是否產(chǎn)生色素、溶血圈（若添加血液成分）等。
如需進(jìn)一步鑒定，可挑取單菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)、涂片染色（如革蘭氏染色）等。
四、注意事項(xiàng)（避免實(shí)驗(yàn)失敗的關(guān)鍵）
瓊脂溶解：必須完全溶解，否則凝固后出現(xiàn)“顆粒狀”，影響微生物生長(zhǎng)和菌落觀察；加熱時(shí)攪拌均勻，防止焦糊（焦糊成分會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)）。
pH 控制：pH 過(guò)高或過(guò)低會(huì)導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)不良（如細(xì)菌在 pH<6 或 pH>8 時(shí)生長(zhǎng)緩慢），需嚴(yán)格校準(zhǔn) pH 計(jì)。
滅菌操作：滅菌時(shí)間不足或溫度不夠，會(huì)導(dǎo)致雜菌污染；滅菌后冷卻過(guò)快，培養(yǎng)基易凝固結(jié)塊（尤其是試管，需及時(shí)制成斜面）。
無(wú)菌操作：接種過(guò)程中避免手、空氣、工具污染培養(yǎng)基（如接種環(huán)未冷卻直接接種，會(huì)燙死微生物；超凈工作臺(tái)未消毒，空氣中雜菌會(huì)落入平板）。
儲(chǔ)存條件：制備好的無(wú)菌培養(yǎng)基（未接種）需密封，4℃冷藏保存，1 周內(nèi)使用（避免瓊脂失水干裂或雜菌污染）；接種后的培養(yǎng)基需及時(shí)培養(yǎng)，避免微生物死亡。
特殊用途調(diào)整：
若培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求高的微生物（如
鏈球菌），可添加 5%-10% 脫纖維羊血（制成“血瓊脂培養(yǎng)基”），增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)并觀察溶血現(xiàn)象。
若需篩選特定微生物，可在滅菌后冷卻至 50℃左右（避免高溫破壞添加物），加入抗生素、染料等選擇性成分（如添加青霉素篩選革蘭氏陰性菌）。
五、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法
問(wèn)題現(xiàn)象 原因分析 解決方法
培養(yǎng)基凝固不良 瓊脂添加量不足；滅菌時(shí)瓊脂分解 按配方補(bǔ)足瓊脂；縮短滅菌時(shí)間（≤20 分鐘）
平板出現(xiàn)雜菌菌落 滅菌不徹底；接種過(guò)程污染；培養(yǎng)基儲(chǔ)存不當(dāng) 重新滅菌；嚴(yán)格無(wú)菌操作；4℃密封保存并盡快使用
微生物生長(zhǎng)緩慢/不生長(zhǎng) pH 不適；營(yíng)養(yǎng)成分不足；培養(yǎng)溫度不當(dāng) 校準(zhǔn) pH；添加酵母提取物/血清增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)；調(diào)整培養(yǎng)溫度
菌落形態(tài)不清晰 培養(yǎng)基水分過(guò)多；接種量過(guò)大 分裝時(shí)控制體積（20mL /皿）；降低接種量，稀釋樣品
六、總結(jié)
酪胨瓊脂培養(yǎng)基的核心價(jià)值是“通用營(yíng)養(yǎng) + 固體支撐”，通過(guò)酪胨提供全面氮源、瓊脂形成固體基質(zhì)，適配絕大多數(shù)微生物的基礎(chǔ)生長(zhǎng)需求。其使用關(guān)鍵在于無(wú)菌操作、精準(zhǔn)配方、規(guī)范滅菌，廣泛應(yīng)用于微生物分離、純化、計(jì)數(shù)及初步鑒定，是微生物實(shí)驗(yàn)室的“基礎(chǔ)工具培養(yǎng)基”。
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