培養(yǎng)基的功能依賴于其成分對(duì)微生物營(yíng)養(yǎng)需求的滿足，NBA 培養(yǎng)基的成分圍繞細(xì)菌生長(zhǎng)的核心需求（碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、凝固劑）設(shè)計(jì)，具體如下：
碳源（能量來源） 葡萄糖、牛肉浸出物中的碳水化合物 為細(xì)菌代謝提供能量，支持其繁殖（異養(yǎng)型細(xì)菌無法自身合成碳源，需從培養(yǎng)基獲?。?/div>
氮源（合成蛋白質(zhì)/核酸） 牛肉浸出物、蛋白胨 提供氨基酸、多肽、核苷酸等，用于細(xì)菌合成蛋白質(zhì)、DNA/RNA 等關(guān)鍵生物大分子。
無機(jī)鹽 牛肉浸出物、氯化鈉 提供 Na?、K?、Ca²?、Mg²?等離子，維持細(xì)菌細(xì)胞滲透壓平衡，參與酶促反應(yīng)（如 Mg²?是 DNA 聚合酶的輔酶）。
生長(zhǎng)因子 牛肉浸出物 含維生素、微量元素等，補(bǔ)充細(xì)菌自身無法合成的小分子物質(zhì)，促進(jìn)生長(zhǎng)。
凝固劑 瓊脂 從海藻中提取的多糖，在 95℃以上溶解、40℃以下凝固，凝固后形成固體基質(zhì)，不被細(xì)菌降解（僅起支撐作用，無營(yíng)養(yǎng)），使細(xì)菌在表面形成孤立菌落。
pH 緩沖 磷酸鹽（部分配方添加） 維持培養(yǎng)基 pH 穩(wěn)定在7.2-7.4（大多數(shù)細(xì)菌的最適 pH，避免 pH 波動(dòng)影響細(xì)菌生長(zhǎng)）。
NBA 培養(yǎng)基的使用需遵循“制備→滅菌→倒平板→接種→培養(yǎng)→觀察”的標(biāo)準(zhǔn)化流程，每一步均需嚴(yán)格控制無菌操作，避免雜菌污染。
1、前期準(zhǔn)備：培養(yǎng)基制備（商品化干粉/自配）
實(shí)驗(yàn)室常用商品化干粉培養(yǎng)基，操作便捷；也可根據(jù)需求自行配制，核心是確保成分溶解均勻、pH 達(dá)標(biāo)。
（1）商品化干粉制備（推薦，操作簡(jiǎn)單）
稱量：根據(jù)培養(yǎng)需求計(jì)算用量（通常 1 L 培養(yǎng)基需干粉30-35 g，具體參考產(chǎn)品說明書），例如：需制備 200 mL 培養(yǎng)基，稱量干粉 6-7 g。
溶解：將干粉加入相應(yīng)體積的純化水（或蒸餾水，避免自來水含有的氯、雜質(zhì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)）中，置于燒杯中，用玻璃棒攪拌至干粉完全溶解（可輕微加熱至 50-60℃加速溶解，避免劇烈煮沸導(dǎo)致成分破壞）。
pH 調(diào)節(jié)：用 pH 計(jì)或精密 pH 試紙檢測(cè)溶液 pH，若偏離 7.2-7.4，用1 mol/L NaOH（調(diào) pH 升高）或1 mol/L HCl（調(diào) pH 降低）緩慢校正，邊加邊攪拌，避免 pH 驟變。
定容：若溶解過程中水分蒸發(fā)，需補(bǔ)加純化水至目標(biāo)體積，確保濃度準(zhǔn)確。
（2）自行配制（需單獨(dú)準(zhǔn)備原料）
傳統(tǒng)配方（1 L）：牛肉浸出物 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 15-20 g、純化水 1 L。操作步驟與干粉制備一致：先將牛肉浸出物、蛋白胨、氯化鈉溶于水中，再加入瓊脂加熱溶解，調(diào)節(jié) pH 后定容。
2、關(guān)鍵步驟：滅菌（確保無菌，避免污染）
未滅菌的培養(yǎng)基含大量雜菌，必須通過高壓蒸汽滅菌法徹底殺滅微生物（包括芽孢），是實(shí)驗(yàn)成功的核心環(huán)節(jié)。
分裝：將溶解好的培養(yǎng)基倒入錐形瓶（體積不超過錐形瓶容積的 2/3，避免滅菌時(shí)溢出），瓶口用雙層牛皮紙或硅膠塞密封（透氣且防污染），貼上標(biāo)簽（注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、操作者）。
滅菌條件：將錐形瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋，設(shè)定參數(shù)：121℃、103.4 kPa（1 atm）、滅菌 20-30 分鐘（若培養(yǎng)基體積 > 500 mL，需延長(zhǎng)至 30-40 分鐘，確保內(nèi)部達(dá)到滅菌溫度）。
冷卻與保溫：滅菌結(jié)束后，關(guān)閉滅菌鍋，待壓力降至 0 kPa、溫度降至 100℃以下時(shí)，緩慢打開排氣閥，取出錐形瓶。若需立即倒平板，將錐形瓶置于50-60℃水浴鍋中保溫（避免瓊脂凝固）；若暫不使用，可室溫冷卻至凝固后，4℃冰箱保存（保質(zhì)期 1-2 周）。
3、倒平板（制備固體培養(yǎng)載體）
“倒平板”是將液態(tài)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化為固體平板的過程，需在超凈工作臺(tái)（無菌環(huán)境）中操作，防止空氣中的雜菌落入。
工作臺(tái)消毒：打開超凈工作臺(tái)的紫外燈，照射 30 分鐘滅菌；關(guān)閉紫外燈，開啟風(fēng)機(jī)，用 75% 乙醇擦拭工作臺(tái)面、錐形瓶外壁及操作者雙手（或戴無菌手套）。
倒平板操作：
取無菌培養(yǎng)皿（直徑 90 mm 或 60 mm），在工作臺(tái)內(nèi)打開皿蓋（僅打開一條縫隙，避免暴露時(shí)間過長(zhǎng)）；
手持錐形瓶，瓶口靠近火焰（通過火焰滅菌，防止瓶口雜菌污染），緩慢將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿倒入15-20 mL（厚度約 3-5 mm，過厚影響菌落觀察，過薄易干裂）；
倒完后，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻覆蓋皿底，避免產(chǎn)生氣泡；
蓋上皿蓋，待培養(yǎng)基自然冷卻至室溫（約 30-60 分鐘，瓊脂完全凝固），即為“營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂平板”。
平板保存：若暫不接種，將平板倒置（皿蓋在下、皿底在上，避免冷凝水滴落污染培養(yǎng)基表面），放入 4℃冰箱保存，使用前需室溫平衡 30 分鐘（避免低溫影響細(xì)菌生長(zhǎng)）。
4、接種與培養(yǎng)（實(shí)現(xiàn)細(xì)菌分離與增殖）
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄈ绶蛛x、純化、計(jì)數(shù)）選擇不同的接種方法，核心是通過無菌操作將待檢樣品（如土壤、水、食品、臨床樣本）中的細(xì)菌轉(zhuǎn)移至平板上。
（1）常用接種方法
接種方法 適用場(chǎng)景 操作要點(diǎn)
劃線分離法 從混合樣品中分離單菌落（純化菌種） 用無菌接種環(huán)蘸取少量樣品，在平板表面按“分區(qū)劃線”，每劃完一區(qū)后灼燒接種環(huán)滅菌，逐步稀釋細(xì)菌，最終形成孤立菌落。
涂布分離法 細(xì)菌計(jì)數(shù)（菌落數(shù)對(duì)應(yīng)樣品中細(xì)菌濃度） 取 0.1-0.2 mL 稀釋后的樣品，滴在平板中央，用無菌涂布器將樣品均勻涂抹在培養(yǎng)基表面，避免樣品堆積。
點(diǎn)種法 快速觀察多個(gè)樣品的生長(zhǎng)情況（如菌種篩選） 用無菌接種針蘸取少量樣品，在平板上按點(diǎn)狀接種（每點(diǎn)間隔 1-2 cm），無需涂抹，直接培養(yǎng)。
（2）培養(yǎng)條件
溫度：大多數(shù)常見細(xì)菌（如
大腸桿菌、
枯草芽孢桿菌）的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；若為嗜冷菌（如某些海洋細(xì)菌），需 20-25℃培養(yǎng)；嗜熱菌需 45-55℃培養(yǎng)。
時(shí)間：根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)速度調(diào)整，一般培養(yǎng)18-24 小時(shí)（大多數(shù)細(xì)菌可形成清晰菌落）；若為慢生長(zhǎng)菌（如
結(jié)核分枝桿菌），需延長(zhǎng)至數(shù)天甚至數(shù)周。
氣體環(huán)境：需區(qū)分細(xì)菌的需氧類型：
需氧菌/兼性厭氧菌（如
金黃色葡萄球菌）：直接置于有氧培養(yǎng)箱中；
厭氧菌（如
破傷風(fēng)梭菌）：需放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐（或厭氧工作站），通入氮?dú)?二氧化碳排除氧氣。
5、結(jié)果觀察與后續(xù)處理
培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板，觀察并記錄菌落形態(tài)（如大小、形狀、顏色、邊緣、表面光滑度、是否產(chǎn)色素等），后續(xù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行進(jìn)一步操作：
純化菌種：挑取形態(tài)典型的單菌落，接種至新鮮的營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂平板或營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，再次培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)物；
計(jì)數(shù)：對(duì)于涂布法接種的平板，選擇菌落數(shù)在30-300 個(gè)的平板（菌落數(shù)過多易重疊，過少誤差大），計(jì)算樣品中的細(xì)菌濃度（公式：細(xì)菌濃度（CFU/mL）= 平板菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) / 接種體積）；
菌種保存：將純培養(yǎng)物接種至斜面培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂斜面），培養(yǎng)后 4℃保存（短期保存，1-3 個(gè)月）；或用甘油管冷凍保存（-80℃，長(zhǎng)期保存）。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與常見問題解決
1、無菌操作是核心：
所有操作（倒平板、接種）必須在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，避免手、空氣、器具帶來的雜菌污染；
接種環(huán)、涂布器等器具需通過火焰滅菌（確保整個(gè)金屬部分燒至紅熱），冷卻后再使用（避免高溫殺死待接種細(xì)菌）。
2、瓊脂凝固與平板質(zhì)量：
倒平板時(shí)培養(yǎng)基溫度需控制在 50-60℃（溫度過高會(huì)燙壞培養(yǎng)皿，過低易提前凝固導(dǎo)致平板不均）；
若平板出現(xiàn)氣泡，可在瓊脂未完全凝固前用無菌針頭挑破；若平板表面干裂，不可使用（影響細(xì)菌生長(zhǎng)）。
3、pH 調(diào)節(jié)的重要性：
培養(yǎng)基 pH 偏離 7.2-7.4 會(huì)顯著影響細(xì)菌生長(zhǎng)（如 pH 過低抑制革蘭氏陰性菌，過高抑制革蘭氏陽性菌），必須嚴(yán)格校正；
滅菌后 pH 可能會(huì)略有下降（約 0.1-0.2），可在滅菌前將 pH 調(diào)至 7.4-7.5，補(bǔ)償滅菌后的下降。
4、常見問題與解決方案：
平板無菌落生長(zhǎng)：可能原因：①待檢樣品中無活菌；②接種操作失誤（如接種環(huán)未冷卻、樣品稀釋過度）；③培養(yǎng)條件不當(dāng)（如溫度錯(cuò)誤、厭氧菌未厭氧培養(yǎng)）。需逐一排查。
菌落過多且重疊：原因是樣品稀釋度不夠，需增加稀釋倍數(shù)（如從 10??調(diào)整為 10??）后重新接種。
雜菌污染（出現(xiàn)非目標(biāo)菌落）：原因是無菌操作不嚴(yán)格，需重新消毒工作臺(tái)、滅菌器具，更換培養(yǎng)基后重試。
四、適用范圍與局限性
1、適用范圍
常規(guī)細(xì)菌的分離、純化、計(jì)數(shù)（如環(huán)境樣品、食品樣品中的細(xì)菌檢測(cè)）；
細(xì)菌菌落形態(tài)觀察與初步鑒定（不同細(xì)菌的菌落形態(tài)有特征性，可作為初步區(qū)分依據(jù)）；
菌種的短期保存與活化（斜面培養(yǎng)基）。
2、局限性
非選擇性：無法區(qū)分目標(biāo)菌與雜菌（如檢測(cè)食品中的
沙門氏菌時(shí)，NBA 培養(yǎng)基會(huì)同時(shí)培養(yǎng)其他雜菌，需使用選擇性培養(yǎng)基如 SS 瓊脂）；
營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單：無法滿足營(yíng)養(yǎng)需求復(fù)雜的細(xì)菌（如乳酸菌需添加乳糖、維生素，結(jié)核分枝桿菌需添加雞蛋黃、甘油），需使用專用培養(yǎng)基。
綜上，
營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基是微生物實(shí)驗(yàn)室的“基礎(chǔ)工具”，其使用需嚴(yán)格遵循無菌操作和標(biāo)準(zhǔn)化流程，核心是通過均衡的營(yíng)養(yǎng)和固體基質(zhì)支持細(xì)菌生長(zhǎng)，為后續(xù)的微生物分離、鑒定和研究提供基礎(chǔ)。
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