微生物菌種冷凍干燥和低溫冷凍保藏技術的操作規(guī)程！
小楊 / 2025-09-22 09:41:05
百歐博偉生物：微生物菌種冷凍干燥保藏是長期保存的首選方法（可保存數年至數十年），低溫冷凍保藏（-20℃/-80℃）則更適合中短期保存或作為應急備份，兩者核心都是通過低溫和脫水降低微生物代謝活性，減少細胞損傷。
一、微生物菌種冷凍干燥保藏技術規(guī)程（長期保存）
冷凍干燥（凍干）通過“凍結 - 真空升華脫水”實現，關鍵是選擇合適的保護劑、控制凍結速率和真空度，最大限度減少冰晶對細胞的破壞。
1、前期準備
菌種選擇：需選擇對數生長期的菌種，此時細胞活性高、抗逆性強。避免使用衰亡期菌種，否則存活率極低。
試劑與器具：
保護劑：根據菌種類型選擇，常用配方如下表。
器具：凍干管（硬質玻璃，帶密封塞）、移液管、培養(yǎng)皿、真空冷凍干燥機、超凈工作臺、高壓滅菌鍋。
器具滅菌：凍干管、移液管等需 121℃高壓滅菌 20 分鐘，烘干后備用；保護劑需過濾除菌（0.22μm 濾膜）或低壓滅菌（115℃，15 分鐘），避免高溫破壞成分。
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2、菌懸液制備（超凈工作臺內操作）
取對數生長期的菌種，用無菌生理鹽水或無菌培養(yǎng)基輕輕沖洗培養(yǎng)物，收集到無菌離心管中。
3000-5000rpm 離心 10-15 分鐘，棄上清液，保留菌體沉淀。
向沉淀中加入適量保護劑，輕輕吹打混勻，制成10^8 - 10^9 CFU/mL的菌懸液（濃度過低會導致復蘇困難）。
3、分裝與預凍結
用無菌移液管將菌懸液分裝到凍干管中，每管裝 1-2mL（液面高度不超過管高的 1/3，便于升華）。
將凍干管放入-80℃冰箱或液氮罐（氣相區(qū)，-150℃以下）預凍結 2-4 小時，確保菌懸液完全凍結（避免后續(xù)真空升華時出現沸騰，導致菌體流失）。
4、冷凍干燥（核心步驟）
將預凍結的凍干管連接到真空冷凍干燥機的樣品架上，確保密封良好。
啟動凍干機，先抽真空至10-30Pa，然后開啟加熱板（溫度控制在 0-5℃，緩慢升溫，避免冰晶快速融化）。
凍干過程持續(xù) 8-24 小時（根據菌懸液體積調整），直至凍干管內物質呈疏松的白色粉末狀，無明顯水分（可用重量法判斷：凍干后重量穩(wěn)定，不再下降）。
5、密封與保存
凍干結束后，在真空狀態(tài)下用火焰熔封凍干管（或用無菌橡膠塞密封，外層套鋁蓋），確保無漏氣。
標記凍干管：注明菌種名稱、菌株編號、凍干日期、操作人員。
保存條件：4℃冰箱（短期，1-2 年）或-20℃冰箱（長期，5-10 年），避免反復凍融。
6、復蘇與質量檢測
復蘇：用無菌鑷子敲碎凍干管，加入 1-2mL 無菌培養(yǎng)基，輕輕吹打溶解凍干物，取 0.1-0.2mL 涂布平板或接種液體培養(yǎng)基，37℃（或菌種最適溫度）培養(yǎng) 18-24 小時。
質量檢測：
存活率：計數平板上的菌落數，計算復蘇后的存活率（需≥50%，否則視為保藏失敗）。
純度：觀察菌落形態(tài)，鏡檢確認無雜菌污染；必要時進行生化試驗或分子鑒定，確保菌種未發(fā)生變異。
二、微生物菌種低溫冷凍保藏技術規(guī)程（中短期保存）
低溫冷凍保藏通過低溫（-20℃/-80℃）直接抑制微生物代謝，操作簡單、成本低，但保存時間較短（-20℃約 6-12 個月，-80℃約 1-3 年），需添加保護劑防止細胞結冰損傷。
1、適用范圍
適合細菌、酵母菌、真菌菌絲體或孢子，不適合對低溫敏感的極端微生物（如嗜熱菌）。
2、前期準備
器具：無菌冷凍管（聚丙烯材質，耐低溫）、移液管、超凈工作臺、-20℃/-80℃冰箱。
3、操作步驟（超凈工作臺內）
菌懸液制備：同冷凍干燥步驟，取對數生長期菌種，用無菌生理鹽水離心收集菌體，加入無菌保護劑，制成 10^8 - 10^9 CFU/mL 的菌懸液。
分裝：將菌懸液分裝到無菌冷凍管中，每管 1-1.5mL，蓋緊蓋子并標記（菌種名稱、編號、保藏日期）。
梯度降溫（關鍵！減少冰晶損傷）：
先將冷凍管放入4℃冰箱1 小時，讓菌體適應低溫。
轉移至-20℃冰箱2-4 小時，使菌懸液緩慢凍結。
最終放入-80℃冰箱長期保存（若用 - 20℃冰箱，保存時間不超過 6 個月）。
（可選）若有程序降溫儀，可設置“1℃/ 分鐘”的降溫速率，從 4℃降至 - 80℃，存活率更高。
4、復蘇與注意事項
復蘇：從 - 80℃冰箱取出冷凍管，立即放入37℃水浴鍋中快速融化（1-2 分鐘內完全融化，避免冰晶反復形成損傷細胞），然后按凍干復蘇方法接種培養(yǎng)。
注意事項：
冷凍管取出后需一次性復蘇完畢，禁止反復凍融（可分裝多管，每次取 1 管使用）。
每 3-6 個月需抽樣復蘇檢測，確認菌種活性和純度，若存活率低于 30%，需重新制備保藏。
三、兩種保藏技術對比
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