大腸桿菌生長曲線的測定之實(shí)驗(yàn)原理與操作步驟及數(shù)據(jù)處理！
小楊 / 2025-09-12 09:54:00
大腸桿菌生長曲線的測定是微生物學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)，通過監(jiān)測一定時(shí)間內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的變化，繪制生長曲線，可反映其生長規(guī)律（遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期四個(gè)階段）。以下是詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)：
一、實(shí)驗(yàn)原理
大腸桿菌在適宜的液體培養(yǎng)基中生長時(shí)，其數(shù)量隨時(shí)間呈現(xiàn)規(guī)律性變化。通過定時(shí)取樣，測定菌液的吸光度（OD 值） 或活菌數(shù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)菌數(shù)量（或 OD 值）為縱坐標(biāo)，繪制曲線即可反映其生長階段。
OD 值測定：基于細(xì)菌懸液的濁度與細(xì)胞數(shù)量正相關(guān)（在一定范圍內(nèi)），操作簡便快速，適用于動態(tài)監(jiān)測。
活菌計(jì)數(shù)：如平板計(jì)數(shù)法，結(jié)果更直觀，但耗時(shí)較長。
二、實(shí)驗(yàn)材料
培養(yǎng)基：LB 液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，加水定容至 1L，pH 調(diào)至 7.0，121℃高壓滅菌 20 分鐘）。
儀器與試劑：
搖床（37℃，恒溫振蕩）、分光光度計(jì)（波長 600nm）、超凈工作臺、高壓滅菌鍋。
試管、錐形瓶（250mL）、移液槍及槍頭（滅菌）、比色皿（滅菌或用無水乙醇擦拭）。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、種子液制備
無菌操作：在超凈工作臺中，挑取大腸桿菌單菌落，接種至含 5-10mL LB 液體培養(yǎng)基的試管中。
培養(yǎng)：37℃、180-200rpm 振蕩培養(yǎng)過夜（約 12-16h），至對數(shù)期（OD???≈0.6-1.0）。
2、接種與培養(yǎng)
取 250mL 錐形瓶，加入 100mL LB 液體培養(yǎng)基，按 1%（體積比）接種量加入種子液（即 1mL 種子液 + 100mL 培養(yǎng)基），混勻。
標(biāo)記為“實(shí)驗(yàn)組”，同時(shí)設(shè)置“空白對照”（僅 100mL LB 培養(yǎng)基，用于校正 OD 值）。
將錐形瓶置于 37℃、180rpm 搖床中培養(yǎng)，同時(shí)記錄起始時(shí)間（0h）。
3、定時(shí)取樣與 OD 值測定
取樣時(shí)間：從 0h 開始，每 1-2h 取樣一次（前 6h 可密集，后期可延長至 2-4h），持續(xù) 24-48h（覆蓋完整生長周期）。
取樣方法：每次從實(shí)驗(yàn)組和空白組中各取 2mL 菌液（無菌操作，避免污染），分別裝入滅菌試管中。
OD???測定：
分光光度計(jì)預(yù)熱 30 分鐘，調(diào)波長至 600nm。
用空白培養(yǎng)基（LB）校正分光光度計(jì)至 OD 值為 0。
將實(shí)驗(yàn)組菌液倒入比色皿，測定 OD???值，記錄數(shù)據(jù)。
若 OD 值超過 0.8（可能偏離線性關(guān)系），需用 LB 培養(yǎng)基稀釋（如 1:2、1:5），測定后乘以稀釋倍數(shù)。
4、活菌計(jì)數(shù)（可選，用于驗(yàn)證）
取不同時(shí)間點(diǎn)的菌液，用無菌生理鹽水梯度稀釋（如 10??至 10??）。
每個(gè)稀釋度取 0.1mL 涂布于 LB 固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng) 16-24h 后計(jì)數(shù) CFU，計(jì)算每毫升活菌數(shù)（CFU/mL = 菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) ÷0.1）。
四、數(shù)據(jù)處理與曲線繪制
繪制曲線：以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD???值（或 lg (CFU/mL)）為縱坐標(biāo)，用 Excel 或 Origin 繪圖，標(biāo)注四個(gè)生長階段：
遲緩期：OD 值增長緩慢（細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境，合成酶類）。
對數(shù)期：OD 值快速線性增長（細(xì)菌以指數(shù)方式繁殖，代謝旺盛）。
穩(wěn)定期：OD 值趨于平穩(wěn)（繁殖與死亡平衡，營養(yǎng)消耗、代謝產(chǎn)物積累）。
衰亡期：OD 值下降（死亡速率 > 繁殖速率）。
五、注意事項(xiàng)
無菌操作：取樣時(shí)避免污染，槍頭、試管需滅菌，操作在超凈臺進(jìn)行。
OD 值線性范圍：大腸桿菌 OD???在 0.2-0.8 范圍內(nèi)與細(xì)胞濃度呈線性，超過需稀釋，否則結(jié)果偏差。
搖床條件穩(wěn)定：溫度、轉(zhuǎn)速需恒定，避免影響細(xì)菌生長速率。
空白校正：每次測定前用 LB 培養(yǎng)基校正，消除培養(yǎng)基本身的濁度干擾。
重復(fù)實(shí)驗(yàn)：建議做 3 次重復(fù)，取平均值，減少誤差。
通過以上步驟，可清晰觀察
大腸桿菌的生長動態(tài)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如基因表達(dá)、發(fā)酵優(yōu)化等）提供參考（如選擇對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）。
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