微生物限度檢查法的具體檢驗(yàn)方法和關(guān)鍵注意事項(xiàng)有哪些？
小楊 / 2025-08-19 10:14:17
百歐博偉生物：微生物限度檢查法是針對非無菌藥品（如口服制劑、外用軟膏、中藥材等）的微生物污染控制手段，核心是檢測藥品中微生物的總數(shù)量（
細(xì)菌、
霉菌和
酵母菌）及特定控制菌（如
大腸桿菌、
金黃色葡萄球菌等），確保其符合安全性限值要求。以下從具體檢驗(yàn)方法和關(guān)鍵注意事項(xiàng)展開說明：
一、微生物限度檢查的核心檢驗(yàn)方法
（一）樣品前處理（關(guān)鍵步驟，影響檢出準(zhǔn)確性）
1、一般樣品處理：
固體樣品（如片劑、中藥材）：稱取 10g 樣品，加入 90mL 無菌稀釋液（如 0.9% 無菌氯化鈉溶液、pH7.0 無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液），經(jīng)均質(zhì)器或研磨制成 1:10 稀釋液（需充分混勻，避免顆粒殘留）。
液體樣品（如口服液、糖漿）：直接取 10mL 樣品，加入 90mL 無菌稀釋液，制成 1:10 稀釋液；若樣品黏稠（如蜂蜜），可先用無菌水稀釋后再處理。
膏狀 / 半固體樣品（如軟膏、乳膏）：取 10g 樣品，加入含無菌吐溫 80 的稀釋液（幫助分散），經(jīng)水浴加熱（40-45℃，避免高溫殺滅微生物）后混勻，制成 1:10 稀釋液。
2、含抑菌成分樣品的特殊處理：
若樣品含防腐劑、抗生素等抑菌物質(zhì)，需通過以下方法消除干擾：
稀釋法：加大稀釋倍數(shù)（如 1:1000），降低抑菌成分濃度（適用于低抑菌活性樣品）。
中和法：加入中和劑（如青霉素酶中和青霉素，硫代硫酸鈉中和含氯消毒劑）。
薄膜過濾法：用 0.45μm 無菌濾膜截留微生物，再用無菌稀釋液沖洗濾膜（一般沖洗 3-5 次，每次 100mL），去除殘留抑菌成分，最后將濾膜轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基培養(yǎng)。
（二）微生物計(jì)數(shù)（總菌數(shù)測定）
1、細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)：
平皿法（最常用）：
取 1:10、1:100、1:1000 等系列稀釋液各 1mL，分別注入無菌平皿，每個(gè)稀釋度做 2 個(gè)平行。
立即倒入融化并冷卻至 45-50℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（約 15-20mL），混勻，待凝固后倒置，30-35℃培養(yǎng) 48 小時(shí)。
計(jì)數(shù)菌落數(shù)（CFU），選擇菌落數(shù)在 30-300 CFU 之間的平皿計(jì)算（若所有稀釋度均低于 30 CFU，以最低稀釋度結(jié)果為準(zhǔn)；若高于 300 CFU，以最高稀釋度結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)）。
薄膜過濾法（適用于低菌數(shù)或含抑菌成分樣品）：取 10mL 樣品（或稀釋液）通過濾膜，沖洗后將濾膜貼于營養(yǎng)瓊脂表面，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。
2、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)：
方法與細(xì)菌計(jì)數(shù)類似，但培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不同：
采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，抑制細(xì)菌生長），20-25℃培養(yǎng) 5 天（若菌落生長緩慢可延長至 7 天）。
計(jì)數(shù)時(shí)注意區(qū)分霉菌（多呈絨毛狀、粉末狀）和酵母菌（圓形或橢圓形菌落，光滑濕潤）。
（三）控制菌檢查（特定致病菌檢測）
控制菌是對人體有潛在危害的微生物（如腸道致病菌、條件致病菌），不同藥品的控制菌種類不同（如口服藥需檢
大腸桿菌，外用藥需檢
金黃色葡萄球菌、
銅綠假單胞菌）。以常見控制菌為例：
增菌：取 10g（或 10mL）樣品，加入 90mL 膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL 培養(yǎng)基，促進(jìn)腸道菌生長），36±1℃培養(yǎng) 18-24 小時(shí)。
分離：取增菌液劃線接種于麥康凱瓊脂平板，36±1℃培養(yǎng) 18-24 小時(shí)，觀察是否有紅色、圓形、邊緣整齊的菌落（大腸桿菌特征）。
鑒定：挑取可疑菌落，進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)（陽性）、甲基紅試驗(yàn)（陽性）、VP 試驗(yàn)（陰性）、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（陰性），四項(xiàng)結(jié)果符合即為陽性。
增菌：樣品加入 7.5% 氯化鈉肉湯（高鹽環(huán)境抑制雜菌，促進(jìn)葡萄球菌生長），36±1℃培養(yǎng) 18-24 小時(shí)。
分離：劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板，36±1℃培養(yǎng) 18-24 小時(shí)，觀察黃色菌落（金黃色葡萄球菌可發(fā)酵甘露醇，使培養(yǎng)基變黃）。
鑒定：挑取可疑菌落，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)（陽性，接種于兔血漿，36℃培養(yǎng) 6 小時(shí)內(nèi)凝固）。
增菌：樣品加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng) 18-24 小時(shí)。
分離：劃線接種于十六烷基三甲基溴化銨瓊脂平板（抑制革蘭陽性菌），36±1℃培養(yǎng) 18-24 小時(shí)，觀察綠色、有金屬光澤的菌落（銅綠假單胞菌產(chǎn)生綠膿素）。
鑒定：氧化酶試驗(yàn)（陽性，用濾紙片沾取菌落，滴加氧化酶試劑，呈紫色）、綠膿素試驗(yàn)（陽性）。
二、微生物限度檢查的注意事項(xiàng)
（一）環(huán)境與操作控制
1、潔凈環(huán)境要求：
檢驗(yàn)需在 Class 10000（ISO 8 級）背景下的 Class 100（ISO 5 級）潔凈工作臺（或生物安全柜）中進(jìn)行，避免環(huán)境微生物污染。
每日操作前需對工作臺、工具（移液槍、培養(yǎng)皿）進(jìn)行消毒（如紫外線照射 30 分鐘 + 75% 酒精擦拭）。
2、無菌操作規(guī)范：
操作人員需穿無菌服、戴口罩和手套，避免手部接觸樣品或培養(yǎng)基。
稀釋液、培養(yǎng)基需提前滅菌（高壓蒸汽滅菌 121℃、15 分鐘），冷卻后使用（避免高溫殺滅樣品中的微生物）。
吸管、培養(yǎng)皿等耗材需無菌，開啟時(shí)避免瓶口 / 皿口對著操作人員或環(huán)境。
（二）方法適用性驗(yàn)證（關(guān)鍵前提）
驗(yàn)證目的：確認(rèn)樣品對目標(biāo)微生物無抑制作用，確保檢驗(yàn)方法能準(zhǔn)確檢出微生物。
驗(yàn)證步驟：
計(jì)算回收率（試驗(yàn)組菌落數(shù) / 對照組菌落數(shù) ×100%），若回收率≥70%，說明方法適用；若低于 70%，需調(diào)整樣品處理方式（如增加稀釋倍數(shù)、使用中和劑）后重新驗(yàn)證。
（三）培養(yǎng)基與試劑質(zhì)量控制
培養(yǎng)基需符合藥典要求，每批需做無菌性檢查（30-35℃培養(yǎng) 14 天無菌生長）和促生長試驗(yàn)（接種 10-100 CFU 目標(biāo)菌，回收率≥70%）。
試劑（如中和劑、染色液）需在有效期內(nèi)使用，避免因變質(zhì)影響結(jié)果（如血漿凝固酶試驗(yàn)用的兔血漿需新鮮，避免凝固失效）。
（四）結(jié)果判斷與記錄
計(jì)數(shù)時(shí)需區(qū)分菌落與雜質(zhì)（可通過顯微鏡觀察：菌落有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，雜質(zhì)無）。
控制菌檢查若出現(xiàn)可疑結(jié)果（如菌落形態(tài)不典型），需重復(fù)試驗(yàn)或采用分子生物學(xué)方法確認(rèn)。
所有操作需詳細(xì)記錄（樣品信息、稀釋倍數(shù)、培養(yǎng)條件、菌落數(shù)等），確?？勺匪?。
（五）特殊樣品的處理要點(diǎn)
中藥材 / 中藥飲片：易含大量孢子和昆蟲殘骸，需先過篩去除雜質(zhì)，稀釋后立即檢驗(yàn)（避免孢子萌發(fā)影響計(jì)數(shù)）。
含酒精的樣品（如酊劑）：需先揮發(fā)酒精（37℃水?。?，再用稀釋液補(bǔ)足體積（避免酒精殺滅微生物）。
栓劑：需在 37℃水浴融化，加入預(yù)熱的稀釋液（40-45℃），混勻后立即冷卻（避免高溫影響微生物活性）。
微生物限度檢查的核心是“準(zhǔn)確檢出、排除干擾”，需嚴(yán)格遵循藥典標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合樣品特性選擇合適方法，并通過全程質(zhì)量控制確保結(jié)果可靠，最終為非無菌藥品的安全性提供保障。
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