細(xì)菌的轉(zhuǎn)化與平板篩選的關(guān)鍵步驟及影響因素與注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-05-09 09:18:41
細(xì)菌轉(zhuǎn)化和平板篩選是分子生物學(xué)中用于將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌并篩選成功轉(zhuǎn)化體的關(guān)鍵技術(shù)。以下是詳細(xì)步驟和注意事項(xiàng)：
一、細(xì)菌轉(zhuǎn)化
1、定義：將外源DNA（如質(zhì)粒）導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，使其獲得新遺傳特性的過(guò)程。
2、關(guān)鍵步驟：
（1）制備感受態(tài)細(xì)胞：
常用化學(xué)法或電擊法使細(xì)胞膜通透。
感受態(tài)細(xì)胞處于可吸收DNA的“敏感”狀態(tài)。
（2）DNA導(dǎo)入：
化學(xué)轉(zhuǎn)化：DNA與感受態(tài)細(xì)胞冰浴混合 → 42℃熱激（90秒）→ 冰浴恢復(fù)。
電擊轉(zhuǎn)化：高壓電脈沖短暫擊穿細(xì)胞膜，促進(jìn)DNA進(jìn)入。
（3）恢復(fù)培養(yǎng)：
加入LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1小時(shí)，使抗性基因表達(dá)。
3、影響因素：
感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)量（效率：化學(xué)法約10?-10? CFU/μg，電擊法可達(dá)10?-10¹?）。
DNA純度及濃度（推薦10-100 ng DNA）。
熱激/電擊條件優(yōu)化（時(shí)間、溫度、電壓）。
二、平板篩選
1、原理：利用質(zhì)粒攜帶的抗生素抗性基因篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌。
2、步驟：
（1）涂布平板：
將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含抗生素（如氨芐青霉素）的瓊脂平板。
37℃倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)。
（2）菌落觀察：
成功轉(zhuǎn)化的細(xì)菌形成單菌落，未轉(zhuǎn)化菌被抑制。
3、進(jìn)階篩選方法：
藍(lán)白斑篩選（α互補(bǔ)）：
質(zhì)粒含LacZ基因片段，插入外源DNA破壞其功能。
在含X-gal的平板上，未插入DNA的菌落呈藍(lán)色，插入的為白色。
4、注意事項(xiàng)：
抗生素濃度需準(zhǔn)確（如氨芐青霉素100 μg/mL）。
避免交叉污染（陰性對(duì)照：不加DNA的菌液涂板）。
菌落過(guò)密時(shí)需稀釋菌液后重新涂布。
三、驗(yàn)證與優(yōu)化
1、陽(yáng)性對(duì)照：使用已知質(zhì)粒驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效率。
2、質(zhì)粒鑒定：
挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。
通過(guò)PCR、酶切或測(cè)序確認(rèn)插入片段正確性。
3、常見(jiàn)問(wèn)題：
無(wú)菌落：檢查抗生素有效性、DNA質(zhì)量、感受態(tài)細(xì)胞活性。
假陽(yáng)性：優(yōu)化藍(lán)白斑條件或增加雙抗生素篩選。
四、總結(jié)
細(xì)菌轉(zhuǎn)化與平板篩選是基因克隆的核心步驟，需嚴(yán)格操作條件并合理設(shè)計(jì)對(duì)照。通過(guò)抗性篩選和輔助方法可高效獲得重組菌，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
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