實驗室植物組織培養(yǎng)外植體消毒步驟和注意事項有哪些？
小楊 / 2025-03-26 09:32:24
百歐博偉生物：植物組織培養(yǎng)中外植體的消毒是一個關(guān)鍵步驟，直接影響培養(yǎng)的成功率。以下是詳細(xì)的消毒步驟和注意事項：
一、外植體預(yù)處理
1、清洗：用自來水沖洗外植體，去除表面泥土和雜質(zhì)。對多毛或蠟質(zhì)層較厚的組織，可加入少量洗潔精浸泡10-15分鐘，增強(qiáng)消毒劑滲透。
2、切割：將外植體切成適宜大?。ㄈ缛~片切成0.5-1 cm²），增加消毒劑接觸面積。操作需在無菌環(huán)境下進(jìn)行，工具需滅菌。
二、常用消毒劑及步驟
1、70%乙醇：浸泡30秒至1分鐘，快速滅殺表面微生物。適用于大多數(shù)外植體，但對幼嫩組織需縮短時間。
2、次氯酸鈉（NaClO）：濃度5-10%（商用漂白液稀釋），浸泡10-20分鐘。分解后釋放氯氣殺菌，需無菌水沖洗3-5次。適用于莖段、種子等較硬組織。
3、雙氧水（H?O?）：3-10%濃度浸泡5-15分鐘，分解為水和氧氣，無殘留。適用于種子或內(nèi)部有空隙的組織。
4、其他消毒劑：升汞（HgCl?，0.1%濃度）因毒性強(qiáng)已少用，必要時需嚴(yán)格處理廢液。
三、特殊處理
1、內(nèi)生菌問題：若外植體內(nèi)部帶菌，可在培養(yǎng)基中添加抗生素（如頭孢霉素50-100 mg/L），但需測試對植物生長的影響。
2、復(fù)雜外植體：如塊莖或果實，可結(jié)合酒精擦拭表面后二次消毒。
四、無菌操作要點
1、超凈工作臺：全程在無菌環(huán)境下操作，使用前紫外線滅菌30分鐘。
2、工具滅菌：鑷子、解剖刀等需高溫高壓滅菌或火焰灼燒冷卻后使用。
3、無菌水沖洗：每次消毒后至少沖洗3次，徹底去除殘留消毒劑。
五、污染控制與優(yōu)化
1、污染觀察：接種后2-7天密切觀察，若污染率高需調(diào)整消毒時間或濃度。
2、存活率平衡：幼嫩組織（如葉片）可縮短次氯酸鈉處理至5-10分鐘；堅硬組織（如種子）可延長至20分鐘。
3、預(yù)處理優(yōu)化：對帶絨毛外植體，乙醇預(yù)處理時間延長至1-2分鐘，增強(qiáng)次氯酸鈉滲透。
六、注意事項
1、個體差異：不同植物種類、組織部位對消毒耐受性不同，需預(yù)實驗確定最佳條件。
2、環(huán)境因素：野外采集樣本需更嚴(yán)格消毒（如兩次次氯酸鈉處理），溫室材料可適當(dāng)減少步驟。
3、安全防護(hù)：操作有毒消毒劑時穿戴手套、護(hù)目鏡，避免直接接觸。
示例流程（以葉片為例）
自來水沖洗葉片30分鐘，軟毛刷輕刷表面。
70%乙醇浸泡40秒，無菌水沖洗1次。
5%次氯酸鈉溶液浸泡12分鐘，期間輕輕搖動。
無菌水沖洗5次，置于滅菌濾紙上吸干水分。
接種至培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)3天后觀察污染情況。
通過系統(tǒng)優(yōu)化消毒方案，可顯著提高外植體存活率并降低污染風(fēng)險，為后續(xù)愈傷組織誘導(dǎo)或再生培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。
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